培养小孢子的全程无菌操作流程

培养所用的器具需高温灭菌，小孢子培养在无菌工作台上进行，全程无菌操作。采用本实验室建立起来的小孢子培养技术进行，具体操作如下：

（1）供体植株的种植管理

一般于9月底或10月初播种，为使供体植株在初花期时处于低温条件，可间隔一周分批播种，田间种植时行距宜在40～50厘米，每塘留苗2株壮苗培养，苗期和蕾薹期追肥一次。

（2）花蕾采集处理

初花时，于上午取主花序花蕾，显微镜下观察为三片瓦形状的小孢子为最佳培养时期，此时的小孢子处于单核后期，培养出胚效率为最佳，适宜大小一般为2～3毫米的花蕾。花蕾用15%的次氯酸钠（每200毫升中加4～5滴表面活性剂）消毒15分钟，用无菌水洗3次。

（3）小孢子分离

加入NLN13培养基，花蕾用玻璃棒进行研磨，尼龙网过滤后转入10毫升离心管中，200转/分钟离心2分钟，弃上清；用NLN13培养基悬浮小孢子，200转/分钟离心2分钟，重复一次；弃上清后，离心管中加入0.5毫升NLN13培养基，并转入培养皿中（含NLN13培养基、活性炭和秋水仙碱），用封口膜将培养皿封好防止污染，放入30℃恒温箱中暗培养24小时；分离获得的即为小孢子。(www.xing528.com)

（4）小孢子培养

将培养24小时后的小孢子悬浮液转移到10毫升离心管中，200转/分钟离心2分钟；弃上清，用NLN13培养基洗2次，弃上清后，加入1～2毫升NLN13培养基，分装到一次性培养皿中（含8～9毫升NLN13培养基）；30 ℃恒温箱中暗培养4～5天后移至25 ℃恒温箱中暗培养；至出现肉眼可见的胚状体后，吸去NLN13培养液，并加入B5培养液于摇床上培养。

（5）小孢子植株培育

小孢子生长到子叶期胚后，用清水反复清洗，洗去表面的糖分。将小孢子胚播种于无菌基质上，温室内控温控湿培养。待成活后再生苗进行移栽种植，壮苗培养后移栽到大田并套袋收种。

采用小孢子培养技术，云南省农业科学院经济作物研究所创制获得一批具有优良性状的种质资源，选育获得多个甘蓝型油菜新品种，创制了用于大籽粒性状、含油量性状的分子标记的遗传群体。后续研究中将进一步优化小孢子培养技术，提高油菜产胚率和再生植株成活率。