小孢子培养技术探究

小孢子是花粉细胞在减数分裂后从四分体中分离出来的单倍体单核细胞，小孢子培养技术是将小孢子从花粉中分离出来，作为个体独立培养，以促进小孢子分裂和发育，并经秋水仙碱作用进行人工染色体加倍，形成胚状体进而形成再生植株获得双单倍体（Double Haploid，DH）植株。以甘蓝型油菜为例，为异源四倍体（AACC，2n=38），小孢子培养的过程是从花粉中获得游离小孢子（AC，n=19），在秋水仙碱的作用下获得DH植株（AACC，2n=38）。DH植株筛选鉴定可直接用于育种程序，可创造性状变异的新种质和创新育种材料。

小孢子培养是快速获得植株纯合单倍体的最有效的技术手段，与传统育种方法相比，可在短期内获得DH植株，快速获得纯合基因型，选择效率大大提高。小孢子培养在种质创新、诱变育种、分子标记辅助育种、遗传作图和基因定位等研究中群体构建等方面起着重要作用。

小孢子培养产胚的主要影响因素有基因型、温度、培养基、小孢子培养密度等。基因型是影响小孢子胚再生植株的重要因素，不同材料间小孢子产胚效率相差很大。供体植株的生长环境对出胚影响也较大，一般而言，供体植株生长温度为2～16℃利于小孢子培养，温度低于0℃造成花蕾冰冻不产胚，温度高于18℃以上不产胚或产畸形胚不能获得再生植株。培养基的类型也会影响小孢子培养效率，一般油菜上使用NLN和B5培养基，蔗糖浓度为13%，即NLN-13和B5-13，pH值为5.8～6.0。小孢子培养密度过低，会影响产胚量或不产胚；密度过高，小孢子之间产生对营养的需求和空间竞争，对小孢子分化产生抑制作用。因此，在小孢子培养过程中要通过不断的试验对培养条件和技术进行优化。

开展小孢子培养所需设备为：电子天平、灭菌锅、恒温箱、倒置显微镜、无菌工作台、冰箱、摇床、低速离心机等。所需试验药品及耗材为：NLN培养基、B5培养基、秋水仙碱、次氯酸钠、表面活性剂、活性炭、75%酒精（主要用于培养过程中台面的消毒）、一次性培养皿等。