测定单拷贝转基因植株不同发育阶段种子淀粉含量的方法

1. 转基因植株的拷贝数鉴定

（1） 标准品制备

按照以下方法构建标准品：受体油菜基因组质量取10纳克，计算含有0、101、102、104、106、108个外源基因拷贝数所需表达载体质粒DNA的质量。公式如下：

[拷贝数×外源基因表达载体大小（含DOF： Glgc为14000 bp和含Cruc： Glgc为14519 bp）] /[受体油菜单倍体基因组DNA大小（5×108bp）] = 外源基因表达载体质量 /受体油菜基因组质量

将不同质量的外源基因表达载体（代表不同拷贝数）与受体油菜基因组DNA（10纳克）混合，构建标准品。DNA的提取参照TIANGEN公司植物基因组DNA提取试剂盒（DP305）说明书进行。

（2）实时定量PCR反应体系制备

按照SYBR Premix TaqTMII（Tli RNaseH Plus）说明书进行PCR反应液的配置：总体积20微升，SYBR Premix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus）（2×）10微升；引物（10 μM）各0.8微升；ROX ReferenceDye （50×）0.4微升；DNA模板2.0微升；dH2O 6微升。Glgc扩增引物为Glgc sqPF： 5’- TCACTAGTTTCCGACGGTTG -3’；Glgc sqPR：5’- CTTCCGGAATAACACAAGCA -3’。反应程序设定：StepOnePlusTMReal-Time PCR System，两步法PCR；反应条件：95℃预变性30秒，95℃变性30秒，60℃退火30秒，循环40次，结束反应。

2. 单拷贝转基因植株不同发育时期种子淀粉含量的测定(www.xing528.com)

分别选取上述经定量PCR鉴定为单拷贝DOF： Glgc和Cruc： Glgc的转基因阳性植株各10株进行套袋、标记。分别取开花后14天、17天、22天、25天、28天、31天、35天、42天、48天的籽粒，进行淀粉含量测定，以转化空载体（不含目的基因）的受体材料种子作为对照。取样时间尽量一致。淀粉含量测定（采用比色法）依照Biovision公司的Starch Assay Kit说明书进行样品制备。植物总淀粉的提取：取5～10毫克籽粒，磨碎，用1毫升90%无水乙醇洗去游离的葡萄糖和寡糖，60℃温育5分钟，期间偶尔振荡。再用10摩尔/升KOH/H3PO4直接洗涤样品，10000克离心2分钟，上清液即为总淀粉。将20微升上清液加入180微升水解缓冲液，混匀后温育30分钟，取50微升混合液进行测定。反应液体系：50微升淀粉提取混合液，46微升温育缓冲液，2微升水解酶混合液，2微升探针。上样后温育30分钟， 避光。采用比色法，OD=570纳米。测定淀粉含量计算公式为：

C=Ay（淀粉含量数值）/Sv（样品上样量，微克/微升或毫克/毫升）

读数时，注意减除所有样品的背景。

3. 转基因阳性植株种子含油量的测定

采用近红外光谱仪法（仪器采用福斯近红外分析仪，型号FOSS 461040），对转基因阳性植株成熟种子进行含油量的测定，以转化空载体（不含目的基因）的受体材料作为对照。

4. 统计方法

采用DPS 7.05软件比较不同启动子转基因阳性植株种子淀粉含量均值差异显著性及淀粉含量与含油量相关性分析。