根肿菌早期侵染抗、感病油菜抗性产生途径探究及几丁质酶作用机理分析

转录组测序数据经过滤获得的clean read映射到油菜参考基因组进行比对，平均68.65%的读长能比对到参考基因组，未比对到的读长占31.35%。比对率偏低的原因可能如下：①获得的读长是以油菜的参考基因组进行比对的，未比对上的基因序列可能为根肿菌的表达产物。根肿菌不能人工培养，只能通过在活体植株上发生侵染表达来进行分析，但现阶段根肿菌缺乏参考基因组，因此这些未比对上的数据未能进行深入分析。本研究中获得的差异表达基因均为寄主在根肿菌侵染条件下寄主的表达产物，而根肿菌在侵染过程中致病相关基因未能进行分析。②测序结果是以法国冬性油菜品种 “Darmor-bzh”为参考基因组进行比对的，该品种与本研究中采用的材料存在较大的遗传背景差异，且“10159”和“ZHE-226”这两个甘蓝型油菜品系均具有远缘杂交的遗传背景，推测是造成比对率偏低的原因之一。

抗病材料R与感病材料S遗传背景差异较大，在4个时间点抗病材料R中共同上调表达的基因为809个，共同下调表达的基因为1082个。对不同接种时间点材料间差异表达基因分析发现，与其他时间点相比48hpi时差异表达基因相对较少，分别为1585个上调表达基因和2097个下调表达基因，推测可能是该接种时间点根毛侵染已经发生而皮层侵染尚未发生，根肿菌和油菜互作进入一个相对平稳的阶段。

本研究中所采用的抗病材料“ZHE-226”是以芜菁“ECD04”为抗原，与感病轮回亲本甘蓝型油菜品种“华双5号”杂交，结合回交和分子标记辅助选择培育的根肿病抗性品系，后从该品系中选育出抗根肿病品种“华双5R”。“ZHE-226”根肿病抗病位点为PbBa8.1，位于A08染色体上。对根肿病其他抗性基因研究发现，Crr1a同样位于A08染色体上，可能与PbBa8.1为等位基因，该基因编码TIR-NB-LRR蛋白，是NBSLRR类型的R基因。另一个抗性基因CRb位于A03染色体上，对2、4和8号生理小种表现抗性。本研究通过对根肿菌早期侵染抗、感病油菜过程中与PTI和ETI防御反应相关的DEGs进行分析，对甘蓝型油菜抗性品系“ZHE-226”可能存在的抗性产生途径进行初步探索。

根据已发表文献中以及甘蓝型油菜基因组注释信息进行搜索，获得与防御反应相关的基因编号，差异基因差异程度采用表达差异倍数进行筛选，即︱log2FC︱≥1，P≤0.05。本研究共对87个在抗、感材料不同接种时间差异表达基因进行了分析，这些DEGs为PRRs（13个）、几丁质酶（12个）、R基因（15个）、WRKY转录因子（21个）、SA（10个）和JA（16个）。

病原菌中保守的PAMPs被植物体内的PRRs检测识别是防御反应的第一步。PRRs均是受体类蛋白激酶，具有高度灵敏性与专化性，能识别纳摩尔以下的PAMP并产生相应的反应。

本研究中一些关键的PRRs基因如类受体蛋白、富含半胱氨酸类受体蛋白激酶等在根肿菌PAMPs作用下在材料R和S中诱导表达，13个PRRs基因中3个在材料R中表达且仅在0hpi时上调表达，其中BnaC06g12920D在72 hpi时下调表达，其余基因在材料S各接种时间点上调表达。Chen等对两个根肿病高抗（CR BJN3-2）和高感（BJN3-2）大白菜的近等基因系接种根肿菌后转录组进行分析，23个PRRs基因被诱导，14个基因在BJN3-2诱导表达，9个基因在CR BJN3-2中诱导表达。Zhao等对拟南芥24 hpi和48 hpi接种根肿菌后转录组分析结果显示，受体激酶在两个时间点差异表达，既有上调也有下调表达，且防御反应的诱导不显著。但在香蕉接种镰刀菌后转录组分析发现，抗性株“Nongke No 1”中PRRs为上调表达。对PRRs表达的研究在不同研究中获得的结果有所不同，推测防御反应较为多变，PTI在抗病油菜和根肿菌互作中作用较小。(www.xing528.com)

几丁质是真菌也是根肿菌细胞壁的重要组成成分，植物体内本身不存在几丁质，但在与病原菌长期相互作用过程中进化获得几丁质酶，它能阻止病原菌入侵和扩散，从而起到抵御病害的作用。几丁质酶在植物体内的诱导和积累对于增强防御能力起重要作用。本研究中与几丁质酶相关的12个基因在材料R和S中差异表达，5个为上调表达，5个下调表达。下调表达基因包含2个PR3类型的碱性几丁质酶，2个几丁质酶家族蛋白，一个class IV几丁质酶。PR3由茉莉酸和乙烯依赖的途径调控，这些基因的下调可能是茉莉酸和乙烯途径未参与油菜对根肿病的抗性，表现为负调控。本研究结果与Chen等采用两个抗病和感病大白菜近等基因系的研究表现出相同的表达模式。在水稻研究中也存在同样的表达模式，通过对表达谱分析PR3家族的成员在正常生长和白叶枯病菌侵染后的水稻叶片中，4个为上调表达，1个下调表达；在不亲和反应中，7个上调表达，3个下调表达。几丁质酶的诱导表达表明在根肿菌入侵油菜时，几丁质酶基因对根肿菌细胞壁上的几丁质起了降解作用，从而使寄主表现抗性。另一方面，在甜菜中受病原物诱导时，抗病品种较感病品种的几丁质酶累积迅速且活性高，但将甜菜几丁质酶基因转入烟草中，该基因表达但不能增强其抗病性。以上研究结果表明，几丁质酶诱导表达存在着极为复杂的机理，在抗性增强方面的作用有待进一步研究。

WRKY家族转录因子与植物的抗逆性和衰老等生理过程有关，在植物体内为非组成型表达，受环境、病原物等各种因子的激发而诱导表达。本研究中21个WRKY基因中，6个在材料R中诱导表达，4个在材料S中诱导表达，11个基因在材料R和S中诱导表达。WRKY52的诱导表达可增强对细菌青枯病的抗性，WRKY70在对霜霉病的基础防御反应和R基因介导的抗病性中起作用，而WRKY7在植物细胞中起转录抑制子的作用，其过表达会增加拟南芥对丁香假单胞菌的感病性。由此可见，WRKY可作为正向或负向调控因子直接对防御反应或防御相关基因的表达进行调控，但对根肿菌侵染油菜中WRKY的调控机理以及通过调控哪些基因起作用等尚不明确。

植物R基因具有保守的结构域且大多为NBS-LRR类，能识别并与病原菌的效应蛋白结合触发防卫反应，是ETI的关键组分。Zhang等对高抗根肿病的甘蓝近缘野生种和高感青花菜接种根肿菌的转录组进行分析，7个NBS-LRR基因在高抗材料中上调表达。Chen等对含有CRb抗性位点的根肿病高抗（CR BJN3-2）与其高感大白菜近等基因系（BJN3-2）进行根肿菌侵染早期转录组分析，研究结果中15个R基因中除2个编码NBSLRR蛋白的基因在抗性株系CR BJN32中下调表达外，其余皆为上调表达，ETI在CRb介导的根肿病抗性中显著诱导并且SA信号分子对根肿病抗性中起重要作用；但是在该研究中未检测到CRb基因的表达。Irani对拟南芥接种根肿菌后根和茎的转录组水平研究中，17个编码NBS-LRR蛋白的基因在接种17天后上调表达，未表现出与抗性基因型相关的表达模式。本研究中诱导表达的16个R基因，在抗病材料R中10个基因上调表达，3个前期下调表达、后期上调表达，总体表现为上调表达，与Chen等的研究结果相同，这表明R基因在根肿病抗性中起重要作用。

此外，对SA和JA介导的抗病信号途径进行了初步探索。JA /乙烯信号途径主要表现在对半活体寄生型病原菌和腐生型的抗病性，SA信号途径主要表现在抵御活体营养型病原菌的侵染过程中。本研究中，16个JA基因诱导表达，在抗病材料R中4个基因上调表达，8个下调表达，其余4个在0 hpi时下调表达，72 hpi时上调表达；SA在抗病材料R中在接种后期表现为明显的上调表达。研究发现感病和抗病植株中都能产生根肿菌根毛侵染阶段，但在抗病植株中不会发生皮层侵染，推测SA在抗病油菜中后期表达可能与抗病反应相关。综上所述，推测“ZHE-226”的抗病性由SA信号介导的抗病信号途径产生，R基因介导的ETI在抗病材料对根肿菌的抵御中激活，其编码的选择性受体与病原物无毒基因编码的配体结合并激发一系列的信号传导过程，触发植物的抗性反应，从而表现为根肿病抗性。

本研究采用的抗、感病油菜尽管遗传背景差异较大，但通过对寄主——病原菌互作中不同时期防御相关基因差异表达分析发现，抗、感病油菜间表现出不同的表达模式和水平。其中，PRRs介导的PTI在感病材料中显著诱导，但在抗病油菜和根肿菌互作中诱导不明显；而R基因介导的ETI与植物自身的抗病基因型紧密关联，在抗病材料中显著诱导，SA信号因子介导的抗病途径对根肿病的抗病性也起到重要作用。通过对根肿病早期侵染过程中抗、感材料的防御反应进行研究，为进一步探索油菜和根肿菌互作提供了分子依据。对“ZHE-226”的抗病性是否确由SA介导的抗病信号途径所调控有待进行验证。油菜和根肿菌互作是较为复杂的过程，寄主表现为抗病或感病是基因相互作用的结果，抗性机制有待进一步深入研究。