接种后30天发病调查及转录组分析结果

1. 根肿病接种试验效果

采用1×107个/毫升根肿病休眠孢子悬浮液灌根法接种油菜幼苗，0 hpi、12 hpi、48 hpi和72 hpi条件下，抗病材料R和感病材料S的根部均无任何症状。为验证接种是否有效，同样接种条件下于30天后进行发病调查。感病材料S主根膨大，须根上也有根瘤，表现出典型的根肿病症状；抗病材料R的根部发育正常，主根和须根上均没有根瘤（后附彩图2-5）。说明本实验中采用悬浮休眠孢子液灌根法进行抗性接种鉴定是有效的。

2. 测序数据质量分析

对0 hpi、12 hpi、48 hpi和72 hpi 4个根肿病接种时间点材料R（记为R0、R12、R48、R72）和材料S（记为S0、S12、S48、S72）根部组织的三个生物学重复进行RNA-Seq分析。转录组分析所用样品RNA的浓度、纯度及完整度经检验符合建库测序的要求。材料S在48 hpi和72 hpi处理条件下，各有一个生物学重复与另两个重复在数据间的重复性较差，因此后续分析中48 hpi和72 hpi仅有两个生物学重复数据。样品测序获得原始测序40193928～41537668条，采用软件trimmomatic过滤后共获得889591326条有效读长，将有效读长比对到油菜参考基因组后，约68.65%能比对到参考基因组。其中比对到单一位置的序列占总序列的比对率为64.74%，比对到多位置的比对率为3.89%（表2-7）。

表2-7　测序数据比对结果

续表2-7

注：样品编号-后的数字代表生物学重复

对测序数据采用PCA主成分分析，抗病材料R和感病材料S这两个不同分组在各接种时间点互相分离，可以清晰地划分，具有特异性（后附彩图2-6）。同一分组中不同样品之间大多排列紧凑、聚合成簇，具有较好的重复性。PCA分析表明序列整体评估优良可用于后续分析。

3. 差异表达基因的分析

对抗、感材料在4个接种时间点表达基因进行差异表达基因筛选，与感病材料S相比，抗病材料R中有12981个基因上调表达，18675个基因下调表达。维恩图显示，0 hpi时4106个基因上调表达，6336个基因下调表达（后附彩图2-7）。随着根肿菌入侵寄主，12 hpi时3143个基因上调表达，4567个基因下调表达；48 hpi时1585个基因上调表达，2097个基因下调表达；72 hpi时4147个基因上调表达，5675个基因下调表达。在4个接种时间点共同上调表达的基因为809个，共同下调表达的基因为1082个。

抗病材料R在12 hpi时（R12_vs_R0）2868个基因上调表达，3102个基因下调表达；48 hpi时（R48_vs_R0）6993个基因上调表达，6101个基因下调表达；72 hpi时（R72_vs_R0）7390个基因上调表达，5196个基因下调表达，1996个基因共同上调表达，2001个基因共同下调表达。感病材料S在12 hpi时（S12_vs_S0）4726个基因上调表达，3573个基因下调表达；48 hpi时（S48_vs_S0）3762个基因上调表达，4046个基因下调表达；72 hpi时（S72_vs_S0）4638个基因上调表达，3132个基因下调表达。1334个基因共同上调表达，1019个基因共同下调表达。

4. DEGs的GO分类和显著性富集分析

采用Gene Ontology数据库和KEGG数据库对4个接种时间点共同上、下调表达的1891个基因进行注释，DEGs的功能可划分为生物学过程（biological process）、分子功能（molecular function）和细胞组分（cellular component）三大类别。

图2-8　差异基因显著性富集分析

注：1：杂环分解过程；2：对化学的反应；3：单糖代谢过程；4：碳水化合物衍生物代谢过程；5：对刺激的反应；6：吡啶核苷酸代谢过程；7：含吡啶复合物代谢过程；8：细胞定位；9：防御反应；10：含吡啶复合物生物合成过程；11：生物过程的负调控；12：聚胺分解代谢过程；13对胁迫反应的调控；14：对防御反应的调控；15：基因表达的负调控；16聚胺代谢过程；17：分解代谢过程；18：碳水化合物代谢过程；19：免疫系统过程；20：次级代谢生物合成过程；21：代谢过程的负调控；22：对几丁质的反应；23：辅因子结合；24：含硫化合物的结合；25：结构分子活性；26：质膜；27：核仁；28：膜旁细胞器；29：细胞内膜旁细胞器；30：细胞器；31：质体；32：细胞内细胞器

生物学过程注释的基因条目数最多，为526个，分子功能注释的基因条目为99个，细胞组分注释的基因条目为164个。生物学过程中，富集基因数目最多的条目依次是：细胞过程（GO：0009987）、代谢过程（GO：0008152）、有机物质代谢过程（GO：0071704）、细胞代谢过程（GO：0044237）、初级代谢过程（GO：0044238）、氮化合物代谢过程（GO：0006807）、对刺激的反应（GO：0050896）等；富集最显著的条目主要是：杂环分解过程（GO：0046700）、对化学的反应（GO：0042221）、单糖代谢过程（GO：0005996）、对刺激的反应（GO：0050896）、吡啶核苷酸代谢过程（GO：0019362）等（图2-8A）。

分子功能中，富集基因条目最多的依次是：结合（GO：0005488）、有机环状化合物结合（GO：0097159）、杂环化合物结合（GO：1901363）、离子结合（GO：0043167）、小分子结合（GO：0036094）等；富集最显著的条目主要为：辅因子结合（GO：0048037）、含硫化合物结合（GO：1901681）、结构分子活性（GO：0003735）等（图2-8B）。(www.xing528.com)

细胞组分中，富集基因条目最多的依次是：细胞（GO：0005623）、细胞部分（GO：0044464）、细胞内（GO：0005622）、细胞内部分（GO：0044424）、细胞器（GO：0043226）、细胞内细胞器（GO：0043229）、膜结合细胞器（GO：0043227）等；富集最显著的条目主要为：质膜（GO：0005886）、核仁（GO：0005730）、膜旁细胞器（GO：0043227）、质体（GO：0009536）、细胞器（GO：0043226）等（图2-8C）。

对各个接种时间点富集最显著的条目进行分析，生物学过程中富集到的条目最多，最显著的条目是：对化学的反应（GO：0042221），对非生物刺激的反应（GO：0009628），对含氧化合物的反应（GO：1901700），细胞代谢过程（GO：0044248），免疫系统过程（GO：0002376），对盐胁迫的反应（GO：0009651），硫化合物代谢过程（GO：0006790），含吡啶复合物合成过程（GO：0072525），糖分解过程（GO：0006096），茉莉酸代谢过程（GO：0009694），黄酮类生物合成过程（GO：0009813），防御反应的正调控（GO：0031349）等过程。分子功能中，最显著的条目是：含硫化合物的结合（GO：1901681），硫离子聚集结合（GO：0051536）等功能类别。细胞组成部分，最显著的条目是：液泡部分（GO：0044437）、细胞壁（GO：0005618）、核仁（GO：0005730）、细胞内细胞器部分（GO：0044446）、质体（GO：0009536）等细胞组件。

5. DEGs代谢途径分析

在KEGG数据库中，以KEGG Pathway为单位，应用超几何检验并通过多重矫正，找出与基因组背景相比在差异表达基因中显著性富集的pathway。KEGG富集分析中，以pvalue＜0.05来衡量富集的显著性。在接种的各时间点，0 hpi时显著富集的通路有28条，12 hpi时显著富集的通路有39条，48 hpi时显著富集的通路有35条，72 hpi时显著富集的通路有47条。

对4个时间点共同上、下调表达的基因进行功能分类和pathway注释，共注释到154条代谢途径。242个DEGs富集到蛋白家族遗传信息代谢途径，157个DEGs富集到新陈代谢途径，151个DEGs富集到信号和细胞过程代谢途径，117个DEGs富集到遗传信息代谢途径，98个DEGs富集到核糖体代谢途径，76个DEGs富集到碳水化合物代谢途径，42个DEGs富集到泛素系统代谢途径，28个DEGs富集到氧化磷酸化代谢途径，26个DEGs富集到植物-病原互作代谢途径。上调差异基因中显著富集的代谢途径有16条，主要富集到基因信息、核糖体、翻译、蛋白家族遗传信息过程、硫代谢、蛋白磷酸酶及其相关蛋白等代谢途径。下调基因显著性富集的代谢途径有20条，主要富集到半胱氨酸和蛋氨酸代谢途径、信使RNA生物起源、翻译、氨基酸代谢、核糖体、丙酮酸代谢等代谢途径。

6. 与根肿病抗性相关的DEGs

为研究根肿菌早期侵染甘蓝型油菜过程中基因表达差异，根据已发表文献和甘蓝型油菜基因组注释关键词搜索获得基因编号，主要对PRRs、几丁质酶、R基因、WRKY转录因子、SA和JA等抗性相关基因进行分析。

（1）PRRs在病原识别中的响应

13个与PRRs相关的基因在油菜根肿菌早期互作中被诱导表达。在抗病材料R中，2个基因BnaA07g14940D和BnaCnng40100D在0 hpi时上调表达，1个基因BnaC06g12920D在0 hpi时上调表达、72 hpi时下调表达，其余10个基因在感病材料S中不同时间点诱导表达。如图所示（后附彩图2-9A），不同接种时间点PRRs基因在抗病材料R中整体表现为下调表达趋势。植物免疫系统的第一道防线是通过PRRs对外来病原体的PAMP进行早期识别，进而启动天然免疫的效应机制。本研究结果显示，在根肿菌入侵油菜过程中，在不同时间点相应的类受体蛋白和类受体蛋白激酶等PRRs在感病材料S中被诱导表达，而在抗病材料中表达不明显。

（2）几丁质酶在根肿菌侵染中的表达

几丁质酶是芸薹根肿菌细胞壁的主要组成成分，是植物体内普遍存在的一类重要的病程相关蛋白，在防御反应中起重要作用。对接种后油菜根组织中几丁质酶基因表达变化进行研究，在抗病材料R和感病材料S中鉴定到12个与几丁质酶相关的基因。与感病材料S相比，抗病材料R中5个几丁质酶基因上调表达，5个下调表达，其中BnaA04g25220D在4个接种时间点均有大量下调表达。此外，BnaC05g01140D在0 hpi时下调表达而72 hpi时上调表达，BnaC08g25190D在0 hpi、12 hpi时下调表达，而72 hpi时上调表达（后附彩图2-9B）。

（3）R基因在根肿菌侵染中的表达

R基因具有共同的保守结构域，大多属于NBS-LRR类。对R基因在抗病材料R和感病材料S间根组织转录组分析发现，与感病材料S相比，在抗病材料R中R基因较为一致地表现为上调表达，15个基因中9个在不同时间点上调表达，3个在前期下调表达、后期上调表达。72 hpi时R基因在抗病材料R中大多为上调表达（后附彩图2-9C），由此推测随着根肿菌的入侵，R基因作为ETI关键的组分，有效结合病原效应蛋白并触发相应免疫反应即ETI，从而在抗性防御中起作用。根肿菌接种30天病害调查显示，抗病材料R未表现症状，表现为根肿病抗性，而感病材料S在根部产生根瘤，表现出典型的根肿病侵染症状。表明在根肿菌侵染油菜过程中，抗病材料R中R基因对根肿菌的侵染起到了防卫作用。

（4）WRKY在根肿菌侵染中的表达

WRKY在植物抵御病原物的应答中起调节作用。接种根肿菌后，抗病材料R和感病材料S中WRKY转录因子差异表达，既有上调表达也有下调表达，并且在侵染的各个时期均有不同程度的表达。其中WRKY6、WRKY9、WRKY23等6个基因在抗病材料R中被诱导，WRKY13、WRKY19、WRKY40、WRKY71这4个基因在感病材料S中被诱导，WRKY29、WRKY46、WRKY50、WRKY53、WRKY57等11个基因在材料R和S中均被诱导，除WRKY57外，其余基因均表现为前期下调、后期上调表达的趋势。如热图所示，在72 hpi时大多数WRKY基因表现为上调表达，特别是BnaA05g01410D和BnaA02g31540D的表达量明显增加（后附彩图2-9D）。

（5）SA在根肿菌侵染中的表达

SA是植物中抗病功能的重要信号分子。对SA在抗病材料R和感病材料S根肿菌接种后基因表达研究发现，在抗病材料R中，2个基因BnaC02g45930D和BnaA03g38630D在72 hpi时显著上调表达，4个基因在接种前期下调表达，72 hpi时上调表达，另外4个基因在接种前期下调表达（后附彩图2-9E）。SA在抗病材料R中表现出前期不表达或下调表达且后期明显上调表达，推测SA可能与抗病材料R的根肿病抗性相关。

（6）JA在根肿菌侵染中的表达

JA可作为信号分子介导植物对生物及非生物胁迫的防御反应，从而诱导相关防御基因的表达。在根肿菌接种不同时期，JA在抗病材料R和感病材料S中诱导表达。16个JA基因中，4个基因在不同接种时间上调表达，8个基因下调表达，其余4个基因在0 hpi时下调表达，72 hpi时上调表达，表现出下调表达的趋势（后附彩图2-9F）。