基因表达模式与发病调查：幼苗期接种的可靠性检验

1. 试验材料和根肿病原

试验材料为甘蓝型油菜根肿病高抗品系“ZHE-226”（记为R），根肿病高感材料“10159”（记为S）为本课题组选育的甘蓝型油菜纯系材料。播种后，于人工气候箱中进行培养，幼苗期进行接种。根肿病原为楚雄东瓜镇采集的油菜发病根瘤。

2. 根肿病接种试验

取单个根瘤接种根肿病感病油菜，发病后收集根瘤经腐烂处理2天后提取休眠孢子。采用灌根法接种，油菜幼苗每钵接种5毫升悬浮液（每毫升休眠孢子悬浮液含1×107个休眠孢子），并于0 hpi、12 hpi、48 hpi、72 hpi取样，用灭菌水清洗根部去除表面的休眠孢子和泥土，取根组织投入冻存管中于液氮中快速冷却，并于-70℃超低温冰箱中保存备用，每个时间点设三个生物学重复。为检验接种是否可靠，于接种后30天进行发病调查。

3. 总RNA提取及质检

采用RNAiso Plus试剂（TAKARA公司）提取总RNA并用DNaseⅠ消化基因组DNA。使用Agilent 2100 Bioanalyzer （Agilent RNA 6000 Nano Kit） 检测RNA的浓度和完整性即RIN值（RNA integrity number），使用紫外分光光度计NanoDrop检测RNA纯度（OD260/280）。(www.xing528.com)

4. cDNA文库构建及RNA测序

RNA经质检合格后，用带有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA；加入打断试剂将mRNA打断成150～200 nt的短片段，以短片段mRNA为模板，用6碱基随机引物反转录合成第一链cDNA，配制反应体系合成双链cDNA，并采用Ampure XP Beads试剂盒纯化双链cDNA。纯化后的双链cDNA进行黏性末端修复，在3′末端加上碱基A并连接接头，最后进行片段大小选择和PCR扩增；构建好的文库用Agilent 2100 Bioanalyzer和ABI StepOnePlus Real-Time PCR System质检合格后，使用IlluminaHiSeqTM 4000测序仪进行测序，委托成都生命基线科技有限公司完成。

5. RNA-seq分析

测序获得的原始数据经过软件trimmomatic质控后得到高质量的clean reads，采用HISAT2软件将clean reads比对到油菜参考基因组（http：//brassicadb.org/brad/datasets/pub/Genomes/ Brassica_ napus/Brassica_napus_v4.1.chromosomes.fa.gz）序列上，采用软件htseq-count提取各个基因上比对到的readscount数值矩阵，用于后续分析。

采用DESeq2软件对各油菜样品进行基因差异表达水平分析，定量方法采用FPKM，差异基因差异程度的筛选采用表达差异倍数（Fold change， FC）的方法，判断条件为︱log2FC︱≥1，P≤0.05。采用Gene Ontology数据库 （http：//geneontology.org）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）数据库（http：//www.genome.jp/ kegg/pathway.html）对油菜基因序列进行注释。采用软件TBtools分别进行GO富集分析和KEGG富集分析。各个时间点基因表达模式用维恩图进行表示，热图采用R软件进行绘制。