禾本草本牧草干旱试验的准备和方法

（一）材料

选取2015年8月～2016年11月试验基地的盆栽土壤，试验材料选取羊草、无芒雀麦、偃麦草和草地早熟禾，4种多年生禾本科牧草。

（二）操作方法

于2015年8月份将供试的4种牧草从野外移栽至东北农业大学香坊农场试验田中，正常田间管理，自然越冬。2016年5月19日，用规格一致的塑料盆装入湿度一致的田园土除去石块等杂质，盆的重量为4.5kg，每种供试牧草选择生长基本一致的植株取其根茎，进行栽种。设对照与处理两组，①对照组：正常浇水保证植株旺盛生长；②处理组：进行干旱胁迫。从出苗五周时开始干旱胁迫试验，干旱胁迫分5个阶段，设停水0天，5天，10天，15天，20天胁迫处理。每处理3个重复，每重复30株大小均匀一致的植株。7月9日为干旱进行的第1天，于停水第0天、第5天、第10天、第15天和第20天，对4种牧草地上部与地下部分别采样测定，地上部取地表以上的茎叶，地下部取其根系，采样时间为早上7∶00～8∶00。

（三）测定方法

土壤含水量的测定：采用烘干法，试验期间每5天取土样20～30G，在105℃的烘箱内进行加热干燥至恒重；其计算公式为：土壤含水量=（土壤湿重-土壤干重）/土壤湿重*100%，式中土壤干重为土样在烘箱加热后失去的水的重量，土壤湿重为烘干前土样的重量。测定生长基质的含水率，3次重复。

形态指标的测定：株高、叶长、叶宽和根长的测定参照《草业科学研究方法》，叶宽以测量叶子最宽处为准，随机取片叶测叶最宽处求平均值。用精确的尺子测量根系长度。

相对生长率（%）=处理日均生长率/对照日均生长率*100%

日均生长率（cm/d）=（后1次绝对株高-前1次绝对株高）/处理日数

叶片含水量的测定：按照东北农业大学郝再彬编写的《植物生理学实验指导》中的方法测定，5次重复。取一定量的鲜样称重后，在105℃下杀青30min，在80℃下烘干至恒重。

计算公式：叶片含水量（%）=（鲜重-干重）/鲜重*100%

叶绿素含量的测定：参照郝再彬主编的《植物生理实验技术》的方法测定。称取新鲜叶片0.2G，放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及2～3ml的95%乙醇，研成匀浆，再加乙醇10ml，继续研磨至组织变白，静置3～5min，过滤后用95%乙醇定容至25ml容量瓶中，以95%乙醇为对照，采用756MC型紫外可见光光度计，在波665nm，649nm，470nm下比色。

计算叶绿素含量：Ca=13.95 A665-6.88 A649Cb=24.96 A649-7.32 A665

其中，Ca：叶绿素A含量；Cb：叶绿素B含量；A665：665nm吸光值；A649：649nm 吸光值；A470：470nm吸光值。

植物细胞膜相对透性的测定：参照郝再彬主编的《植物生理实验技术》的方法测定。取茎叶0.2G，加蒸馏水20ml，25℃恒温浸提30min，用DDS-11A型直读电导仪测定导率，再将样品在沸水浴上浸提10min，冷却再测其电导率。叶片质膜相对透性用相对电导率表示。(www.xing528.com)

游离脯氨酸含量的测定：参照郝再彬主编的《植物生理实验技术》的方法测定。取不同处理的剪碎混匀的样品0.2G研磨后分别置于大试管中，加入5ml3%磺基水杨酸溶液，管口加盖玻璃球，于沸水浴中浸提10min。取出试管，待冷却至温室后，吸取上清液2ml，加2ml冰乙酸和3ml显色液，于沸水浴中加热40min，加入5ml甲苯进行萃取，在756型紫外分光光度计520nm下测定消光值。根据标准曲线查出测定液中脯氨酸浓度，计算样品中脯氨酸含量。

脯氨酸（uG/GFW）=（C*V/a）/W

其中，C：提取液脯氨酸浓度（uG）；V：提取液总体积（ml）；a：测定时所吸取体积（ml）；W：样品鲜重（G）。

丙二醛含量的测定：参照郝再彬主编的《植物生理实验技术》的方法测定。硫代巴比妥法，取样品1G，加入10%TCA（三氯乙酸）研磨至匀浆，匀浆以4000X离心10min。吸取离心的上清液2ml（对照加2ml蒸馏水），加入2ml 0.6%，硫代巴比妥酸溶液，混匀物于沸水浴上反应15min，迅速冷却后再离心。取上清液用紫外可分光光度计测定532nm，600nm，和450nm波长下的消光度。

计算公式：C（umol/L）=6.45（D532-D600）-0.56D450

C为MDA的浓度，D532、D600、D450分别代表532nm，600nm，和450nm波长下的消光度值。再根据植物组织的重量计算所测样品中的MDA含量（umol/G）。

MDA浓度（umol/L）可由公式C（umol/L）=6.45（D532-D600）-0.56D450计算；

MDA含量（umol/G）=C*N/W，其中N：提取液体积；W：植物组织鲜重。

植物组织中过氧化物酶活性测定：参照郝再彬的方法。取样品2G切碎，放入研钵中，加适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆。将匀浆液全部转入离心管中，于3000转离心10min，上清液转入25ml容量瓶中，定容至刻度，低温下保存备用。酶活性测定的反应体系包括：2.9ml 0.05mol/L磷酸缓冲液；1ml 2%H2O2；1ml 0.05mol/L愈创木酚和0.1ml酶液。用加热煮沸5min的酶液为照，反应体系加入酶液后，立即于37℃水浴种保温15min，然后迅速转入冰浴中，并加入2.0ml 20%三氯乙酸终止反应，过滤（或5000转离心10min），470nm波长下测定吸光度。结果计算以每分钟内A470变化0.01为1个过氧化物酶活性单位。

超氧化物歧化酶活性测定：参照郝再彬的方法。取样品0.5G于预冷的研钵中，加入2ml预冷的提取介质在冰浴下研磨成匀浆，加入提取介质冲洗研钵，并使终体积为10ml。取5ml于4℃下1000转离心15min，上清液即为SOD粗提液。取透明度好，质地相同的15mm*150mm试管并设对照，分别加入0.05mol/L，磷酸缓冲液1.5ml，130mmol/L钾硫氨酸（MET）溶液0.3ml，750umol/L NBT0.3ml，EDTA-Na2 0.3ml，100umol/L核黄素溶液0.3ml，酶液0.1ml，水0.5ml混匀后，给1支对照管罩上比试管稍长的双层黑色硬纸套遮光，与其他各试管同时置于4000lx日光灯下反应20～30min。反应结束后，用黑布罩于试管，终止反应，遮光的对照管作为空白，分别在560nm波长下测定各管的吸光度，计算SOD的活性。

可溶性糖含量的测定：参照郝再彬的方法。称取样品剪碎的混合样0.2G，转移至试管中，向每个试管中加入10ml蒸馏水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30min，将提取液过滤入25ml容量瓶中，定容至刻度。吸取0.5ml提取液于试管中，加入0.5ml蒽酮乙酸乙酯和5ml浓硫酸，充分震荡，冷却后在630nm下比色，计算可溶性糖含量。

可溶性蛋白质含量测定：参照郝再彬的方法。采用考马斯亮蓝法，称取0.5G样品，用5ml缓冲溶液研磨成匀浆后，10000转＇离心10min，取上清液1.0ml放入具塞试管中（每个样品重复2次），加入5ml考马斯亮溶液，充分混合，放置2min后在595nm下比色，测定吸光度，计算蛋白质含量。

（四）统计学方法

本试验的原始数据的整理采用统计软件完成，差异显著性检测采用SAS6.12软件完成。采用数学分析法一一隶属函数法对抗旱性进行综合评价。