紫花苜蓿的转基因改良研究

与其他牧草相比，紫花苜蓿的转基因研究进行的较早、较为广泛、也较为成功。自年首例由农杆菌介导的苜蓿转化获得成功，至今苜蓿转基因研究取得了很大进展，在苜蓿的遗传转化中，各种转化方法都有应用，包括电击法、微注射法、基因枪法、离子注入法和农杆菌介导法等。1986年，Reich等用显微注射法将外源Ti质粒导入紫花苜蓿原生质体，最后得到转化的愈伤组织。1995年，Pereira和Erickson用基因枪轰击紫花苜蓿愈伤组织获得了稳定遗传的转基因植株。在国内，黄绍兴等（1991）采用电击法将GUS基因导入紫花苜蓿根原生质体中，产生转基因植株，转化频率为6%；徐恒等（2001）用电击转化法将携带GUS基因的pBII21质粒导入紫花苜蓿愈伤组织的小细胞团内，并检测到GUS基因在受体组织中的瞬时表达；金湘等（2007）利用离子注入法将麻黄和甘草总DNA成功导入紫花苜蓿中，并能够在后代中稳定遗传。但是，在紫花筒蓓转基因研究中，应用最广泛、最成功的方法要属农杆菌法。该方法的优点是外源基因能稳定地整合进寄主植物的基因组中并得到有效表达，还可以直接用植物的外抗体进行操作，便于进一步的培养和转基因植株的再（王关林和方宏筠，2002）。紫花苜蓿的转基因具有改良牧草品质、生产可食性疫苗、根瘤菌共生固氮调控机制等优点。

（一）改良牧草品质

在改良牧草品质中，是通过提高含硫氨基酸（SAA）含量，提高消化率，消除腻胀病等途径来实现的。

紫花苜蓿干物质中蛋白质含量高达17%～20%，但其中含硫氨基酸（SAA）从的含量却较低（Tabe等，1995）。研究表明，提高牧草饲料中SAA的含量，可使羊毛产量提高22%以上，同时，如果将SAA与其他氨基酸配合使用，可以显著提高羊的生长量，但其他氨基酸不能代替SAA的作用（Reis，1979；Radcliffe等，1985）。通过将外源高含硫氨基酸蛋白基因转入紫花苜蓿，可望为提高紫花苜蓿饲草的营养价值提供一条有效的途径。

1991年，Schroeder等将鸡卵清蛋白基因转入苜蓿，从转基因植株中检测出了大量鸡卵清蛋白。随后，Tabe等（1995）将富含硫氨基酸的向日葵种子清蛋白基因（SFA8）转入紫花苜蓿栽培品种，发现转基因苜蓿叶片中SAA蛋白含量占叶片总可溶性蛋白的0.1%，若作为饲料可为绵羊每天额外提供40mg的SAA。Bagga等（2004）将富含甲硫氨酸的δ-和β-玉米醇溶蛋白（δ-和β-zein proteins）基因同时导入紫花苜蓿，发现转基因苜蓿叶片中积累了较多的玉米醇溶蛋白，奶牛瘤胃试验表明这些富含甲硫氨酸的醇溶蛋白能够稳定地通过瘤胃而不被分解，从而提高了其在小肠中的吸收率。在我国，吕德扬等（2000）通过农杆菌介导将高含硫氨基酸蛋白基因HNP导入苜蓿，转基因植株中含硫氨基酸含量显著提高。

另外，拟南芥胱硫酸γ-合成酶（AtCGS）主要控制蛋氨酸合成途径中第一个中间代谢物的合成，Avraham等（2005）将编码其编码基因导入紫花苜蓿，转基因植株中游离蛋氨酸、S-甲基蛋氨酸（SMM）以及蛋白结合型蛋氨酸含量分别高出野生型的32倍、19倍和2.2倍，游离半胱氨酸（蛋氨酸合成中S的供体）、谷肤甘肽（半胱氨酸的贮藏和转运形式）以及蛋白结合型半胱氨酸含量分别比野生型植株高了2.6倍、5.5倍和2.3倍。

紫花苜蓿细胞壁中存在过量的木质素，严重影响牧草的品质。通过控制木质素生物合成过程中的一些关键酶来改变紫花苜蓿木质素的含量和组成，可望提高紫花苜蓿的利用率、消化性和营养价值。

双子叶被子植物主要含有紫丁香基（Syringyl，S），和愈创木基（Guaiacyl，G）2种木质素单体，它们的生物合成至少由咖啡酸3-O-甲基转移酶（COMT）和咖啡酰基辅酶A3-O-甲基转移酶（CCoAOMT）所催化。Guo等（2001）将COMT和CCoAOMT的cNDA反义表达载体分别导入紫花苜蓿，成功获得了反义表达COMT和CCoAOMT的转基因植株。分析发现，与各自野生型对照相比，转基因植株中COMT和CCoAOMT的活性均显著下降，木质素含量也明显降低。COMT的下调导致G和S单体含量都下降，而CCoAOMT的下调只降低了G单体的含量，S单体的含量并未受到影响，这表明紫花苜蓿中CCoAOMT对于S单体生物合成的3-O-甲基化阶段的贡献不大。虽然通过反义表达COMT和CCoAOMT均能降低紫花苜蓿木质素含量和组成，但细胞壁多糖的组成并未受到影响。瘤胃实验表明，与COMT相比，CCoAOMT的下调更能提高苜蓿的消化率。

羟基肉桂酰辅酶A（Hydroxycinnamoyl CoA，HCT）是近年发现的木质素单体合成过程中负责插入3-羟基的关键酶。Shadle等（2007）使该酶在紫花苜蓿中反义表达、转基因植株中木质素含量显著降低，单体的组成也发生显著改变，牧草消化率提高了近20%。

肉桂醛辅酶A还原酶（Cinnamoyl CoA reductanse，CCR）和肉桂醇（酸）脱氢酶（Cinnamyl alcohol dehydrogenase，CAD）是催化木质素单体合成最后2步的关键酶。采用RNA干扰技术成功地降低了苜蓿中CAD酶的活性，植株中木质素的含量虽未发生变化，但其组成却发生了很大改变，从而提高了木质素的溶解性，增加了苜蓿的消化率和利用率。Jackson等（2008）分别获得了反义表达CCR和CAD的转基因紫花苜蓿，结果发现这2种酶的活性在各自的转基因植株中均大幅下降，转基因植株的消化率也显著提高，但相比CAD，CCR的反义表达显著提高了转基因紫花苜蓿茎部的糖化效率（Saccharification efficiency）。

紫花苜蓿被家畜采食后，其中的水溶性蛋白与叶绿体颗粒容易在家畜瘤胃和网胃中形成大量不易破裂的气泡，堵塞喉管，导致鼓胀病，引起牲畜厌食甚至死亡（刘志鹏等，2003）。研究发现，缩合单宁（Condensed tannins，CT），可作为一种蛋白质凝结剂用于防止鼓胀病的发生（Goplen等，1980）。植物的原花色素（Proanthocyanidin，PA）是一种类黄酮多聚体，是CT的基本组成单元。它不仅可以消除臌胀病，还能提高植物蛋白向动物蛋白的转化效率，降低胃肠寄生虫发生率，抑制昆虫采食。因此，将PA生物合成途径中的某些调控基因导入紫花苜蓿可能会极大地提高这种优良牧草的利用价值。植物花青素（Anthocyanin）与原花色素生物合成的早中期是相同的，都涉及到查耳酮合成酶（CHS）、查耳酮异构酶、黄烷酮3β-羟化酶（F3 H）和黄烷酮醇还原酶（DFR，Winkel-Shirley，2001）。植物花青素的生物合成受myb-类基因和myc-类基因调控（Ludwing和Wessler，1990），Ray等（2003）将玉米花青素的1个myc-类调控基因（Lc）和2个myb-类（B-Peru，CI）分别转入紫花苜蓿，结果显示：Lc在转基因植株叶片中强烈表达，但红紫色花青素只有在强光或低温下才会积累，这两种胁迫条件还诱导了CHS和F3H在Lc转基因植株中的表达；Lc转基因植株中黄酮含量下降，茎叶和发育种子中无色花青素还原酶（调控代谢产物进入原花色素途径）的活性增强，植株中积累了大量原花色素聚合物。虽然能够检测到B-Peru和CI基因在各自转基因植株中的表达，但转基因植株的表型并未发生明显变化，表明紫花苜蓿中原花色素的生物合成可以被myc-类基因所激活，这为培育抗鼓胀病的高品质紫花苜蓿品种提供了一条新的出路。

（二）生产可食性疫苗

紫花苜蓿可以作为生物反应器在研制可食疫苗（如口蹄疫疫苗和猪传染性肠胃炎疫苗）、工业酶制剂（如植酸酶和纤维素酶）和工业可降解塑料（如多羟基丁酸）及一些重要的药用蛋白（如人IgG抗体）等方面已经取得了一定进展。

近4年～5年间通过转基因紫花苜蓿研制可食性疫苗方面的一些最新的重要成果有：

肝片吸虫护，是牛羊及其他数十种哺乳动物胆道内的常见寄生虫，人体亦可感染。黎万奎等（2003）将肝片吸虫主要保护性抗原基因FH3由根癌农杆菌介导转入紫花苜蓿，为肝片吸虫可食植物疫苗的研究奠定了基础。

曼氏溶血杆菌，主要引起牛等动物的出血性肺炎，白细胞毒素是该菌的一种重要的保护性抗原（Confer等，1995）。Lee等（2001）将Lkt中Lkt50的片段基因转入白三叶中，用转基因植株饲喂的兔子体内产生了Lkt毒素的抗体。Ziauddin等（2005）将Lkt50基因与绿色荧光蛋白（GFP）基因融合后导入紫花苜蓿，在转基因植株中检测到Lkt50-GFP蛋白的表达。Western杂交表明，转基因植株中存在的全长多肽。此外，GS60是曼氏溶血杆菌外膜脂蛋白的成员之一，是该菌又一重要的保护性抗原（Lo，2001），Lee等（2008）将其衍生物（GS6054）的一段简单序列通过农杆菌导入紫花苜蓿，通过Western杂交在转基因植株中检测到了GS6054抗原，而且该抗原蛋白可以在干草中稳定储存1年以上；转基因苜蓿饲喂兔子后，其体内产生了抗体。这些研究为最终获得牛出血性肺炎的可食疫苗奠定了基础。

禽呼肠孤病毒，主要引起鸡病毒性关节炎/腱鞘炎，降低受精率、产蛋率以及引进免疫抑制而继发其他疾病，造成严重的经济损失。其结构蛋白δ-C是开发疫苗的首选蛋白，由S1基因组编码。Huang等（2006）分别用CaMV35S启动子和Actin启动子与S1构建了p35S-S1和pAct1-S1 2个表达载体，并通过农杆菌介导将它们分别导入苜蓿染色体组。Western杂交结果表明，δ-C蛋白在p35S-S1、pAct1-S1转基因苜蓿中都高度表达，分别占这2种转基因植株中可溶性蛋白总量的0.008%和0.007%，为发展抗ARV的可食疫苗铺平了道路。(www.xing528.com)

轮状病毒，是引起婴幼儿和幼龄动物急性肠胃炎的主要病原体，感染率和发病率都相当高，常常对人类健康和畜牧业造成较大危害（Dodet等，1997）。Dong等（2005）将人A组轮状病毒VP6蛋白编码基因经密码子优化重组后导入紫花苜蓿，转基因植株中VP6蛋白占可溶性蛋白总量的0.28%；用转基因苜蓿蛋白提取物（含VP6蛋白）含蛋白饲喂雌鼠后，其体内能够产生高滴度的抗VP6的血清IgG和黏膜IgA，雌鼠所产生的特异性抗体能够诱导乳鼠产生被动免疫，并为乳鼠提供异源交叉保护，从而使其免受轮状病毒的侵害。这一研究成果为生产安全可靠的人畜共用轮状病毒可食疫苗奠定了基础。

产肠毒素性大肠杆菌凡，是导致婴幼儿和幼龄动物腹泻的又一重要病原。Joensuu等（2006）将ETEC的一个主要亚基FaeG的DNA转入紫花苜蓿中并使其定位于叶绿体中，转基因植株中FaeG蛋白占其全部可溶蛋白的1%，而且能在干草中于室温下稳定储存2年用转基因苜蓿蛋白提取物辅以免疫佐剂霍乱毒素（Cholera toxin，CT）饲喂断奶仔猪，仔猪排泄物中ETEC的检出量显著降低。在我国，武冬梅等（2007）将ETEC的肠毒素STⅠ、STⅡ和LTB基因融合后导入紫花苜蓿，转基因植株表达了重组抗原蛋白，Western杂交显示该重组抗原蛋白具有免疫原性。

（三）根瘤菌共生固氮调控机制

紫花苜蓿生长所需的很大一部分N元素主要通过其根系与根瘤菌的共生固氮作用从空气中获得（Heichel等，1981）。谷氨酰胺合成酶（GS）/谷氨酸合酶（GOGAT）循环主要负责最初N的同化（Temple等，1998）。Schoenbeck等（2000）将一个由根瘤菌诱导型启动子AAT-2（天冬氨酸氨基转移酶）驱动的NADH-GOGAT反义表达载体转入紫花苜蓿，结果发现：在转基因植株体内，随着NADH-GOGAT酶蛋白mRNA的减少，NADH-GOGAT酶活性降低了近50%；在根瘤菌共生条件下，转基因植株体内N含量降低，出现黄萎和生长减缓等症状，补施N肥后这些症状有所减轻；而且转基因植株表现出雄性不育。Cordoba等（2003）构建了由大豆血红蛋白启动子lbc3调控的NADH-GOGAT基因反义表达载体，并转入紫花苜蓿，发现在所有的转基因植株及其后代中，NADH-GOGAT的活性受抑，从而降低了根瘤中C/N的同化。这些结果表明，NADH-GOGAT在紫花苜蓿的共生固N和花粉发育中扮演着重要的角色。

谷氨酰胺合成酶（GS）能够催化NH3和谷氨酸合成谷氨酰胺。在植物中GS主要有GS1和GS2两种同工酶，分别分布于细胞质和叶绿体中。Temple等（1995）在紫花苜蓿体内发现了种功能完全不同的同工酶，其基因的编码区同源性很高，但在35-非转录区（35-UTR）高度特异。随后，他们利用反义RNA技术将这2种同工酶的下调基因分别转入紫花苜蓿，结果发现这2种基因的转录水平均下降了80%左右，而且在所有转基因植株中均未检测到它们的转录产物，这说明有同源序列存在时，下调基因的转录产物是不稳定的。同时，虽然各下调基因的转录水平明显下降，但GS活性和GS1蛋白水平均未受到影响，这表明GS1 mRNA水平并不受GS1蛋白合成速度的限制，GS1蛋白水平不仅受转录水平的调控，而且受转录后水平、翻译水平或翻译后水平的调控；在紫花苜蓿GS1基因表达过程中，翻译后水平可能发挥着重要作用（Temple等，1998）。Ortega等（2001）将35S启动子驱动的大豆谷氨酰胺合成酶基因（GS1）转入紫花苜蓿，也发现了类似的结果：GS1转录产物在转化植株叶中大量积累，而在根瘤中却没有积累，但将带有GUS基因的GS1基因转入苜蓿后，转化植株根瘤中却检测到了GUS的转录活性，这说明GS1基因在根瘤中的转录产物不稳定；GS1的转录产物随着土壤中氮含量的变化而增减，在低氮条件下，转基因苜蓿叶中大量积累GS1的转录产物，而在高浓度NO3-存在下，GS1的转录水平却显著下降；但在转基因植株叶中并没有检测到GS1活性或多肽水平的明显变化。根据这些研究结果，他们提出了一个初步模型，即GS蛋白可能受到多个阶段的调控。第1阶段是在翻译水平上的调控，但这一阶段的具体机制还不清楚；第2阶段是转录RNA稳定性的调控，该阶段可能受GIn/GIu比值、ATP/ADP比值或氧化还原平衡的影响；第3阶段是酶蛋白稳定性的调控，这包括GS被氧化还原反应所产生的O-自由基的所钝化（Ortega等，2001）。随后，他们又发现的GS1的35-非转录区对转基因紫花苜蓿中GS1的转录产物和GS1的积累具有调控作用（Ortega等，2006）。Seger等（2009）将分别由CaMV35S强启动子和叶肉细胞特异表达启动子RUB驱动的大豆GS1基因导入紫花苜蓿并使其超表达，发现：2种转基因植株中GS1转录水平和GS1蛋白的积累量有显著差异，但GS1的活性却并无太多不同，再次证明GS1可能受翻译后酶蛋白稳定水平的调控；与未转化植株相比，2种转基因植株中可溶性蛋白、光合速率以及光呼吸速率均显著增加，而且增加量大致相同。这些结果说明在叶肉细胞中，GS1参与了对光呼吸和蛋白质降解过程中所产生的NH4+的再同化。

植物凝集素在植物的生长发育中有着重要的作用。Brill等（2001）发现，反义表达紫花苜蓿凝集素MsLEC1和MsLEC2基因的转化植株胚胎发生出现明显异常，营养生长和生殖生长受到严重干扰，这表明MsLEC1和MsLEC2蛋白在苜蓿胚胎发生乃至苜蓿的整个生长过程中都发挥着重要的作用。随后他们又将MsLEC1和MsLEC2基因在紫花苜蓿中正义或反义表达，然后用野生根瘤菌接种转化植株，结果发现：MsLEC1反义表达的转化植株（LEC1AS）矮化，多瘤（不仅有不规则的大瘤，也有大量的小瘤），而且瘤体容易早衰；MsLEC2反义表达的转化植株（LEC2AS）的生长和瘤的数量介于LEC1AS植株和对照植株之间；MsLEC1正向转化植株也出现了与LEC1AS植株相似但程度稍轻的共生畸形，但MsLEC2正向转化植株却表现出与未转化植株相一致的正常共生反应。Northen杂交分析表明，转化植株根瘤中并无MsLEC1 mRNA的积累，但原位杂交发现，MsLEC1 mRNA被定位在转化苜蓿根瘤分生组织和侵入点附近的细胞中，在根部分生组织中也检测到了MsLEC1的转录产物；通过原位杂交还发现，MsLEC3具有与MsLEC1相似的转录产物分布模式（Brill等，2004）。以上结果证明，豆科植物凝集素在根瘤菌-植物共生过程中可能起关键作用。

（四）提高抗性

提高抗性主要体现在抗病虫性、抗除草剂、非生物胁迫抗性等方面。

病毒主要由衣壳蛋白（Coat protein，CP）和核酸组成，以裸露的核酸在植物细胞中复制增殖。研究发现，通过病毒衣壳蛋白对病毒重新包装或抑制病毒脱壳可以中断病毒在植物细胞内的复制过程。因此，向目标植物中导入病毒衣壳蛋白相关基因，是目前植物抗病毒基因工程中最有效的手段之一。1991年，Hill等向紫花苜蓿中导入编码苜蓿花叶病毒（ALMV）衣壳蛋白基因，在转基因植株叶中发现了该病毒的CP蛋白，接种试验表明：与对照植株相比，转基因植株在较高ALMV病毒浓度（50mg/ml）下仍具较强的抗性，而且还对马铃薯花叶病毒（PVX）、黄瓜花叶病毒（CMV）和烟草花叶病毒（TMV）等病毒表现出一定的抗性。

几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶分别催化真菌细胞壁的两种主要组分——几丁质和β-1，3-葡聚糖的水解，从而可抑制真菌的繁殖和发展。Mizukami等（2000）将水稻的几丁质酶（RCC2）基因转入苜蓿，发现转基因植株对紫色丝核菌（Rhziocyonia）和齐整小菌核（Sclerotium rolfsii）等真菌具有较强抗性；Masoud等（1996）发现，过量表达β-1，3-葡聚糖酶的转基因紫花苜蓿植株对大豆疫病菌（Phytophthora megasperma）有良好的抗性。Tesfaye等（2005）将哈茨木霉菌（Trichoderma harzianum）内切丁质酶（ech42）基因和白羽扇豆（Lupinus albus L.）酸性磷酸酶（APase）基因融合后转入紫花苜蓿，转基因植株营养器官和根系分泌物中几丁质酶的蛋白含量和活性均显著增加，对苜蓿茎点霉（Phama medicaginis）和炭疽病（Colletotrichum trifolii）2种病原真菌的抗性也显著提高。植保素是植物受病原物侵染后自身产生或积累的一类起防卫作用的次生代谢产物，对真菌有较强的毒性。Hipskind和Paiva（2000）将花生的植保素——白黎芦醇合成酶基因导入紫花苜蓿，在转基因植株中发现了一种新合成的化合物Rgluc，对苜蓿轮纹病菌有较好的抗性，并对苜蓿坏死病斑、失绿现象及病原孢子的繁殖有一定的抑制作用；He和Dixon（2000）将豆科植物异黄酮-O-甲基转移酶（IOMT）基因在紫花苜蓿中过量表达，转化植株对苜蓿轮纹病也表现出较高的抗性。

在紫花苜蓿抗虫基因工程方面，近年来也取得了一定进展。目前所使用的抗虫基因主要有三大类：苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）的杀虫晶体蛋白基因、从植物中分离出的蛋白酶抑制剂（Proteinase inhibitor，PI）基因和植物外源凝集素基因。Bt主要作用于昆虫的神经系统，但对脊椎动物不具毒性。Strizhov等（1996）将一个Bt杀虫晶体蛋白基因cryIC转入紫花苜蓿，转基因苜蓿中cryIC毒素含量占植株总可溶性蛋白的0.01%～0.2%，对海灰翅叶蛾和甜菜叶蛾等昆虫均表现出较高的抗性。PI可以抑制昆虫消化系统中的蛋白酶，使蛋白质无法降解，引起昆虫营养不良，甚至死亡。Thomas等（1994）将马铃薯PI和适当改造的烟天蛾PI基因导入紫花苜蓿，转化植株对咀嚼式口器昆虫具有明显的毒杀作用，通过电镜发现，转化植株叶细胞的液泡中积累了大量PI蛋白。

紫花苜蓿防除杂草最为直接和有效的手段就是喷洒化学除草剂，但目前所使用的大多数除草剂都会对其生长发育产生不利影响。把除草剂抗性基因导入苜蓿，得到抗除草剂的转基因苜蓿，不失为解决这难题的一个有效途径。D·Halluin等（1990）将广谱性除草剂Basta和Heibac的抗性基因导入苜蓿，田间试验结果表明，与对照植株相比，转基因植株对常用除草剂Basta具有明显抗性。Atrazine（莠去津）是一种在美国被一泛使用的除草剂，它可以被土壤中革兰氏阴性细菌体内的莠去津氯水解酶（atzA）所降解，Wang等（2005）将经过优化的atzA编码基因p-atzA导入紫花苜蓿，转基因植株在含有不同浓度莠去津的培养条件下均可正常生长。在国内，刘艳芝等（2004）利用农杆菌介导法将抗草丁磷的Bar基因导入草原1号苜蓿，经叶片筛选试验证实转基因植株对除草剂Basta具有抗性。

在低温、干旱等逆境条件下，植物体内会产生大量ROS，干扰和破坏植物细胞正常的生理功能。因此，把编码抗氧化酶的基因导入苜蓿，可望为提高紫花苜蓿抗氧化能力开辟一条新的途径，这方面的研究主要集中在超氧化物歧化酶（SOD）基因的转化上。Boeler等（1989）将烟草（Nicotiana plumbaginiflia）Mn-SOD的cDNA导入紫花苜蓿，发现转基因植株及其后代SOD活性均有增强，抗寒性也有显著提高。随后，Mckersie等（1993）用烟草Mn-SOD cDNA转化紫花苜蓿，转化植株及其F1代对除草剂二苯乙醚的抗性增强，而且低温胁迫后再生能力明显提高。3年田间试验表明，这些转基因紫花苜蓿的耐寒性和抗旱性显著增强，在低温和水分胁迫后成活率和田产草量也大幅度增加（Mckersie等，1996）2000年，Mckersie等还将拟南芥Fe-SOD基因转入紫花苜蓿，转基因植株的越冬成活率明显增加。Samis等（2002）用Mn-SOD转化紫花苜蓿，发现转基因植株的抗逆性和生物量均明显增加。Rubio等将Mn-SOD和Fe-SOD同时转入紫花苜蓿，发现在转基因植株叶中，抗坏血酸过氧化物酶和过氧化氢酶的活性升高，而在根瘤中却下降；在轻度水分胁迫后，转基因植株的光合活性平均提高了20%。韩利芳和张玉发（2004）将烟草Mn-SOD基因转入保定苜蓿，发现部分转基因植株Mn-SOD的活性显著高于对照植株。

植物表皮的蜡层在植物抵御逆境中也发挥着重要的作用。Zhang等（2005）从截形苜蓿（Medicago truncatula）中克隆了一个蜡层形成相关基因AP2的转录因子WXP1并将其转入紫花苜蓿，结果发现超表达WXP1转基因苜蓿的叶片表面蜡层密度和积累量均显著增加，叶片的水分损耗显著降低，抗旱性显著增强，水分胁迫后不易出现萎蔫，复水后也能更快更好地恢复生长。

酸性土壤中存在过多的铝离子，铝离子主要抑制植物根系的生长，常常造成植物严重减产。紫花苜蓿对土壤铝毒非常敏感，我国南方水热资源丰富，但土壤多偏酸性，限制了紫花苜蓿南移。研究发现，植物可以通过其体内的有机酸与铝离子螯合来减轻铝对其根系的危害（Hocking，2001）。通过转化一些有机酸合成相关基因可以提高苜蓿的耐铝性。有关这方面的研究主要集中在苹果酸脱氢酶（Malate dehydrogenase，MDH），和柠檬酸合成酶（Citrate synthase，CS）基因的转化上。Tesfaye等（2001）将MDH的cDNA导入紫花苜蓿，转基因植株根系分泌物中柠檬酸、草酸、苹果酸、琥珀酸和乙酸的含量均有所增加，植株的耐铝性也相应增强。罗小英等（2004）将苜蓿根瘤中苹果酸脱氢酶基因neMDH转入紫花苜蓿，发现在铝胁迫下，转基因植株根长比对照高出3.6%～22.5%。此外，Barone等（2008）还将绿脓杆菌的CS基因导入紫花苜蓿，与野生型植株相比，转化植株耐铝性显著增强。

在通过基因工程改良苜蓿耐盐性方面，近年来也取得了一些进展。Winicov和Bastola（1999）发现转录因子Alfinl在紫花苜蓿中过量表达能够增强与脯氨酸合成相关的基因MsPRP2在根系中的表达。进一步分析发现，AlfinI转基因紫花苜蓿的生长明显增加，耐盐性也显著增强，AlfinI基因为苜蓿根系生长所必需（Winicov，2000）。在国内，晏石娟等（2006）、王瑛等（2007）分别将果聚糖合成酶基因（SacB）和大麦lea3基因转入紫花苜蓿，与各自的野生型对照相比，转基因苜蓿耐盐性均显著增强。