转基因紫花苜蓿的抗逆性探究

（一）材料与方法

选取其表达水平最高（系列1，以下简称L1）和最低（系列8，以下简称L8）的2个系列进行研究。以经过相同再生过程获得的未转化植株作为野生型对照（以下简称WT）。将经过炼苗的组培苗移栽至由珍珠岩、蛭石和草炭土（1∶1∶1）组成的人工土壤，土壤使用前高压灭菌后使用，放入光照培养箱中于24±2℃、16h/d光照下用1/8Hoagland营养液进行培养，每2d更换一次营养液，培养初期保持90%以上的相对湿度，待移栽苗表现出生长趋势后，每天平均按3%～5%的降幅逐步降低相对湿度，直至相对湿度降65%为左右。然后采用扦插法扩繁实验材料，用剪刀剪取转基因植株和未转化植株4cm长的茎段作为插条，插条含3个芽。将插条下端在近芽出剪成斜面，放入100mg/L的萘乙酸（NAA）溶液中浸泡15s后，插入由蛭石和珍珠岩（1∶1）组成的混合基质中，扦插深度为1.5cm，插条的形态学上端留2个芽，然后放入光照培养箱于24±2℃、16h/d光照下用1/2Hoagland营养液进行培养，每2d更换一次营养液，培养期间始终保持80%以上的相对湿度。8～10d后，插条产生不定根，选取根长（2cm）、苗高（5～6cm）以及长势基本一致的扦插苗作为本实验的植物材料。

（1）短期胁迫实验

NaCl处理：将转基因系列（L1和L8）和野生型对照的根长（2cm）、苗高（5～6cm）以及长势基本一致的扦插苗移栽到装有混合基质（珍珠岩：蛭石=1∶1）的立方形塑料育苗钵（4*5*5cm，每钵1株）中，用1/2Hoagland营养液每2d浇灌1次，期间蒸发的水分用蒸馏水进行补充。培养4周后，开始用含有50mmol/L NaCl的1/2Hoagland营养液浇灌。随后每2d递增50mmol/L NaCl，至终浓度（100、200mmol/L）后每1d更换1次溶液，以保持NaCl浓度的相对恒定。NaCl处理7d后，取样测定相关指标。以未加NaCl的1/2Hoagland营养液浇灌的幼苗为对照。对照和处理各设3个重复，每个重复包含20个营养钵。培养室温度为24±2℃，光照为16h/d，光照强度约为600μmol/m2/s，相对湿度为60±5%。

干旱处理：将转基因系列（L1和L8）和野生型对照的根长（2cm）、苗高（5～6cm）以及长势基本一致的扦插苗移栽到装有人工土壤（珍珠岩：蛭石：草炭土=1∶1∶1）的圆柱形黑色塑料营养钵（8*10cm，每钵1株）中，用1/8Hoagland营养液每2d浇灌1次，至田间最大持水量并维持4周后停止浇水，让土壤自然变干。直到所有植株均出现较为严重的干旱胁迫症状，比如萎蔫，然后恢复浇水至田间最大持水量。干旱处理期间，每隔1d或2d，视情况而定，取样测定相关指标。每个处理各设3个重复，每个重复包含20个营养钵。培养条件同上。

缺磷（Pi）处理，将转基因系列（L1和L8）和野生型对照的根长（2cm）、苗高（5～6cm）以及长势基本一致的扦插苗移栽到装有珍珠岩，主要成分为石英，不含磷的圆柱形黑色塑料营养钵（8*10cm，每钵1株）中，用含有10μmol/L NH4H2PO4，的Hoagland营养液（减少的N用NH4NO3补齐）每2d浇灌1次，期间蒸发的水分用蒸馏水进行补充。培养21d后取样测定相关指标。以含1mmol/L NH4H2PO4的全Hoagland营养液浇灌的幼苗为对照。对照和处理各设3个重复，每个重复包含20个营养钵。培养条件同上。

（2）长期盆栽实验

NaCl处理：采用盆栽实验，选取通风光照条件良好地点。实验采用10*12cm圆柱形黑色塑料育苗钵，实验用土质主要为黄绵土。将转基因系列（L1和L8）和野生对照的根长（2cm）、苗高（5～6cm）以及长势基本一致的扦插苗移入育苗钵，每钵3株，正常浇水15d后开始浇灌含有不同浓度NaCl的自来水，每天浇灌1次。设置3个处理：①Control（mmol/L NaCl）；②50mmol/L NaCl；③100mmol/L NaCl。每个处理重复6次。盐处理20d后取样测定相关指标。

干旱处理：采用盆栽实验，实验地点和所用土壤相同。实验采用15*20cm塑料育苗钵。将转基因系列（L1和L8）和野生对照的根长（2cm）、苗高（5～6cm）以及长势基本一致的扦插苗移入育苗钵，每钵6株，每天正常浇水20天后留茬5cm刈割，然后正常浇水5天，最后进行不同强度的干旱处理。设置3个处理：①Control，正常浇水；②中度干旱胁迫，土壤含水量为田间最大持水量的60；③重度干旱胁迫，土壤含水量为田间最大持水量的40%。每天用台秤监测土壤含水量，并根据土壤水分含量的变化情况，采用定量灌溉的方法使田间持水量分别维持到各处理的水平，每个处理重复4次，干旱处理35天后取样测定相关指标。

（3）指标检测

形态指标：用直尺量取株高。将冲洗干净的根系和地上部分别于80℃下烘干48h后称取其干重，然后计算植株总干重和根冠比。每个处理随机测定18株。

阳离子含量：用火焰分光光度法测定叶和根中的Na+、K+、Ca2+的含量。需要注意的是：测定叶片阳离子含量时，要取植株同一高度的叶片；在测定根系阳离子含量前，首先将冲洗干净的根系用去离子水浸泡10s，再用50mmol/L冰冷的LiNO3溶液浸泡2min以交换根自由空间中的离子，之后用去离子水冲洗3次，吸干表面水分。取样时各处理的每个重复中随机取2份，3个重复共取6份。

净光合速率（Pn）：使用LI-6400便携式光合仪测定目标植物的净光合速率。每个重复中随机选取2株，共选择6株。每个植株选取2个同一高度的叶片，每个测定数据重复5次，最后求其平均值。

根系活力：参考Zhong和Huang（2005）的α-萘胺氧化法，稍作改进。称取根尖约0.5g，放入100ml三角瓶中，加入40mg/L α-萘胺溶液和0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.0）的等量混合液50ml，把根充分浸没在溶液内，轻轻摇动，静置5min使根完成吸附，吸取2ml溶液放入25ml容量瓶中，完成第1次取样。然后用保鲜膜密封三角瓶口，置于恒温振荡器上于25℃暗保温3h，此后再次吸取2ml溶液放入25ml容量瓶中，完成第2次取样。由于α-萘胺在空气中会自动氧化，故须做空白试验，不加根样，其他操作同上。在每次取样的容量瓶中，各加蒸馏水10ml、1%对氨基苯磺酸1ml和100mg/L亚硝酸钠1ml，充分摇匀后放置5min，使之显色，然后用蒸馏水定容至25ml。用紫外分光光度计在510nm下比色。查标准曲线，分别求出两次取样的α-萘胺浓度。最后用以下公式计算根系活力根系活力：

其中A1和A2为样品2次测定的α-萘胺浓度、A’1和A’2分别为空白实验2次测定的α-萘胺浓度，单位均为mg/L，T为保温时间；V为第二次取样时混合液的体积（48ml）。取样时各处理的每个重复中随机取2份，3个重复共取6份。

植株总含量：将整株样品在80℃下烘干48h后测定其干重，放入坩埚中于电炉上小心碳化，然后置于Muffle炉中在600℃下灰化3～5小时，最后用10ml盐酸和数滴硝酸煮沸消化灰分，调pH至中性后定容于100毫升容量瓶中。总Pi含量的测定参考Murphy和Riley（1962）的磷钼蓝法，稍作调整。取样时各处理的每个重复中随机取2株，3个重复共取6株。

数据分析：利用SPSS 15.0软件对数据进行单因素方差分析，用Duncan多重比较进行差异显著性分析，最小差异显著性水平为P=0.05。

（二）结果与分析

（1）AVPI转基因紫花苜蓿耐盐性和抗旱性检测

AVPI基因的超表达增强了转基因紫花苜蓿的耐盐性：正常条件下（0mmol/L NaCl），2个转基因系列和野生型植株在形态上并无任何差异。然而，在200mmol/L NaCl下处理10d后，转基天植株比野生型植株表现出更强的耐盐性；L1和L8转基因苜蓿均能保持正常的生长状态，而野生型的生长却严重受抑，出现萎蔫、甚至死亡症状。NaCl处理7d后的地上部生物量测定结果，从中可以看出：所有植株的地上部干重均随着盐浓度的增大而逐渐下降，但在同一盐浓度下，2个转基因系列的地上部干重均显著高于野生型植株（P＜0.05）。如在200mmol/L NaCl下，L1和L8的地上部干重分别是野生型植株的2.5倍和2.2倍。另外，在盐胁迫下，L1和L8的第几部卜重也存在差异，特别是在200mmol/L NaCl下，的地上部干重比的显著高出13.6%。

AVPI基因的超表达增强了转基因紫花苜蓿的抗旱性：水分胁迫实验结果表明，停止浇水6d后，野生型植株生长受到抑制，并开始出现萎蔫，而转基因植株仍然能够正常生长，直到第8d发生萎蔫；恢复浇水1d后，转基因植株解除萎蔫，野生型植株则发生永久萎蔫；复水4d后，2个转基因系列均完全恢复正常生长，而野生型植株则已经枯死。这表明了AVPI基因的超表达提高了转基因紫花苜蓿对水分胁迫的抵御能力。此外，无论在水分胁迫期间和复水后，L1转基因植株的生长状况要好过L8，复水4d后，L1植株的地上部干重是L8的1.7倍（P＜0.05），这与盐胁迫下的情况相似，说明转基因苜蓿耐盐性和抗旱性的强弱同AVPI基因的表达水平密切相关。

AVPI转基因紫花苜蓿体内积累了更多的阳离子：①即使在正常生长条件下，2个转基因系列的叶片Na+和K+含量就已经显著高于野生型植株（P＜0.05）。②随着NaCl浓度的增加，2个转基因系列和野生型植株叶和根中的Na+含量均极显著增加（P＜0.05），但转基因植株的增加幅度更大，在同一盐浓度（100和200mmol/L NaCl）下，L1和L8转基因植株叶和根中的Na+含量均显著高于野生型植株（P＜0.05），NaCl处理7d后，转基因植株和野生型植株叶和根中的K+含量均有所下降，但相比野生型植株，2个转基因系列的叶和根中积累了更多的K+，NaCl处理后，与各自对照（0mmol/L NaCl）相比，Ca2+含量在转基因植株的叶和根中均显著增加，但野生型植株中只有在其根中显著升高，因此在100mmol/L和200mmol/LNaCl下，2个转基因系列叶和根中Ca2+的积累量均显著高于野生型植株（P＜0.05）。③与盐胁迫下的情况相似，随着干旱胁迫的加剧，转基因植株叶和根中的Na+、K+和Ca2+积累量均显著增加（P＜0.05），相反，野生型植株中仅Na+的含量在叶和根中同时增加，其他2种阳离子含量只在根中小幅上升，这使得在水分胁迫期间，2个转基因系列叶和根中的3种阳离子的积累量均显著高于野生型植株（P＜0.05）。④在NaCl或干旱胁迫一下，L1转基因植株总是比L8积累了更多的阳离子。以上结果说明AVPI超表达提高了转基因紫花苜蓿的阳离子吸收和积累能力，而且这种能力与AVPI基因的表达水平密切相关。

AVPI的超表达降低了转基因紫花苜蓿的叶片渗透势：即使在正常生长条件下，2个转基因系列（L1和L8）的叶片渗透势就显著低于野生型植株（P＜0.05），分别比野生型植株低36.8%～62.2%和32.2%～55.7%。当受到盐或干旱胁迫时，所有植株的叶片渗透势均显著下降（P＜0.05）；但在同一胁迫条件下，转基因植株的渗透势总是显著低于野生型植株（P＜0.05）。比如在200mmol/L NaCl下处理7d，L1和L8的渗透势绝对值分别是野生型植株的1.5倍和1.3倍；同样，干旱胁迫6d后，2个转基闪系列的叶片渗透势绝对值分别是野生型植株的1.6倍和1.4倍。可见转基因紫花苜蓿比野生型植株在叶片中积累了更多的渗透调节物质，从而使其具有更强的渗透调节能力，抵御盐或干旱所引起的渗透胁迫。(www.xing528.com)

AVPI的超表达提高了转基因紫花苜蓿的叶片保水力。随着水分胁迫时间的延长，所有植株的叶片相对含水量都逐渐下降，但相比之下，野生型植株叶片相对含水量的下降速度明显快于转基因植株。经过6天的水分胁迫后，野生型植株叶片失水最多，相对含水量仅为0.51，比胁迫前下降了45%，而转基因植株叶片失水速度较慢，L1和L8的相对含水量仍然保持在0.82和0.75仅分别下降了13%和20%，显著高于野生型（P＜0.05）；在水分胁迫的第8天，野生型植株的相对含水量急剧下降到0.26，而转基因型植株L1和L8却仍分别维持在0.62和0.52。这些结果进一步说明，AVPI基因的超表达提高了转基因紫花苜蓿的渗透调节能力，从而使其具有更高的保水力，在水分胁迫下能够维持自身的膨压。

AVPI的超表达对转基因紫花苜蓿的光合作用具有保护作用。随着NaCl浓度的增加和干旱处理时间的延长，所有植株的净光合速率都不断下降；但相比L1和L8转基因植株，野生型植株的净光合速率下降更快，在同一胁迫条件下，其值显著低于2个转基因系列（P＜0.05）。例如，在200mmol/L NaCl下生长7d后，野生型的净光合速率下降幅度高达74.1%，而L1和L8则分别下降了42.8%和50.9%；同样，经过6天的水分胁迫，野生型植株的净光合速率下降了68.2%，而L1和L8转基因植株仅分别下降了30.8%和44%。说明在盐或干旱胁迫下，转基因植株仍然保持着较高的光合能力，这可能是导致转基因植株在胁迫环境中能正常生长的重要原因之一。

AVPI的超表达对转基因紫花苜蓿的细胞膜具有保护作用。为了研究盐和干旱胁迫对转基因紫花苜蓿和野生型植株细胞膜的伤害程度，本实验测定了反映细胞膜损伤程度的2个指标：叶片MDA含量和相对质膜透性。结果显示：随着盐浓度的增加和水分胁迫程度的加剧，叶片MDA含量和相对质膜透性在转基因紫花苜蓿和野生型植株中均呈现不断增加趋势；但在相同胁迫条件下，2个转基因系列的叶片MDA含量和相对质膜透性均显著低于野生型植株（P＜0.05）。200mmol/L NaCl处理7d，L1和L8的叶片MDA含量分别比野生型植株的低44.7%和23.1%、相对质膜透性分别比野生型植株的低50.8%和31.4%；同样，水分胁迫6天后，2个转基因系列叶片MDA含量和相对质膜透性分别比野生型低34.3%和18.4%、52.8%和39.8%。这些结果表明，AVPI的超表达可以增强转基因紫花苜蓿细胞膜结构的稳定性，从而减轻盐或干旱胁迫对转基因植株的伤害。

AVPI的超表达增强了转基因紫花苜蓿的根系活力，当受到盐或水分胁迫时，野生型紫花苜蓿的根系活力急剧下降（P＜0.05），而2个转基因系列的根系活力则表现出较为复杂的变化趋势。在盐胁迫下，随着盐浓度的增加而缓慢下降；在干旱胁迫的第3d显著升高、第6d显著下降。但不论在盐或干旱处理下，转基因植株始终比野生型植株保持更高的根系活力（P＜0.05）。在200mmol/L NaCl下，转基因系列L1和L8的根系活力分别是野生型的2.2倍和1.6倍。干旱胁迫6d后则分别是野生型植株的2.1倍和1.9倍。可见，AVPI的超表达可以使转基因苜蓿根系在盐或干旱胁迫下保持较为健康的状态，这将有助于其吸收更多的水分和养分。

（2）长期盐或干旱胁迫下转基因紫花苜蓿的生长发育

在不同盐浓度下生长22天后，2个转基因系列的生长发育明显好于未转化野生植株，特别是在100mmol/L NaCl处理下，野生型植株已经死亡，但转基因植株仍然正常生长。在各盐浓度下，转基因植株的株高都高于野生型植株。相比L8，L1系列的表现更好，例如在100mmol/L NaCl下处理20d后，L1的株高比L8显著高出11.5%。进一步测定生物量的结果表明：正常条件（0mmol/L NaCl）下，2个转基因系列和未转化植株的地上部干重和整株生物量均无显著差异，但L1的根干重和根冠比分别比野生型植株高出35.7%和35.4%，L8的则分别高出野生型对照的30.8%和33.8%，且差异均为显著；随着盐浓度升高，转基因植株和野生型植株的各生物量指标均显著降低，根冠比均显著升高（P＜0.05），但在同一盐浓度下，转基因植株的地上部生物量、根系生物量以及根冠比均显著高于野生型植株（P＜0.05），比如在100mmol/L NaCl下，L1的以上3个指标分别是野生型植株的1.4倍、2倍和1.4倍，而L8的则分别是野生型植株的1.3倍、1.7倍和1.3倍；在转基因系列之间，L1的上述指标均高于L8。

为了研究转基因紫花苜蓿对长期干旱胁迫的响应情况，将2个转基因系列和野生型植株在正常浇水条件下盆栽20天后刈割，然后再正常浇水5天，最后进行为期35天的不同强度干旱处理。结果发现，不论正常浇水，还是干旱处理，转基因植株（特别是L1）的生长发育要明显好于野生型植株。在正常浇水条件和中度干旱（60% of FWC）条件下，2个转基因系列的株高分别比野生型植株显著高出21.6%～35.8%和15.5%～27.4%。但在重度干旱（40% of FWC）条件下，L1的株高显著高于L8和野生型植株（P＜0.05），而L8与野生型植株之间没有显著差异。生物量的测定也得到了相一致的结果：正常浇水条件下，L1的地上部干重、根干重以及根冠比分别比野生型植株的高35.2%、78.3%和32.2%，而L8的则分别比野生型植株的高27.8%、48.7%和16.0%，且差异均为显著。随着干旱程度的加重，所有植株的根和地上部干重均显著下降，根冠比显著增大（P＜0.05）。在中度干旱条件下，L1和L8的上述3个指标均显著高于野生型植株（P＜0.05）。在重度干旱条件下，L1的根干重、地上部干重和根冠比仍然显著高于野生型（P＜0.05），而L8的根干重、地上部干重与野生型植株的并无显著差异，说明L8对重度干旱胁迫的适应性不如L1的高，这可能与AVPI在L8中较低的表达水平有关，但有趣的是，L8的根冠比却比野生植株的高21.6%，差异显著。

研究结果表明，AVPI在紫花苜蓿中的超表达促进了转基因植株的生长，特别是根系的发育，而粗壮发达的根系有利于植株对水分和各种矿质元素的吸收，提高了植株对盐和干旱环境的适应能力，从而保证其地上部的生长更为茂盛。

（3）转基因紫花苜蓿耐瘠薄性的检测

AVPI的超表达增强了转基因紫花苜蓿的耐瘠薄性。在正常生长条件下（1 mmol/L Pi），野生型植株和转基因植株的地上部生长并无明显差异；在低磷（10 μmol/L Pi）条件下培养21天后，所有植株的地上部和根系生长发育都有所减弱，但相比2个转基因系列，野生型植株的生长受抑程度最重，其株高比L1低36.3%，差异显著，比L8低16.3%，但差异不显著。无论有无养分胁迫，与野生型植株相比，转基因植株的根系更加粗壮、发达。

生物量测定数据表明：在正常条件下，2个转基因系列的地上部干重、整株干重与野生型植株之间差异不显著，但前者的根干重和根冠比要显著高于后者（P＜0.05），根干重分别是野生型L1的1.5倍和L8的1.3倍，再次说明AVPI超表达促进了转基因植株的根系发育；在低磷条件下，所有植株的地上部干重、根干重和整株干重均显著降低，根冠比显著升高（P＜0.05），但2个转基因系列的根干重、地上部干重以及根冠比分别比野生型植株的高，L1的96.5%、39.7%和L8的41.2%以及54.6%、20.7%和23.5%，差异显著；无论在何种条件下，L1要比L8的表现更好。

AVPI的超表达促进了转基因紫花苜蓿对磷的吸收。正常条件下（1 mmol/L Pi），L1和L8转基因系列吸收了更多的Pi，其单株含磷量（μmol/plant）分别是野生型植株的1.4倍和1.3倍，差异显著，单位干物质中的含磷量（μmol/g DW）也高于野生型植株，其中L1高出31.9%，差异显著，L8高出18.3%，但差异不显著。当受到养分胁迫（10 μmol/L Pi）时，2个转基因系列和野生型体内的Pi含量均大幅下降（P＜0.05），但转基因系列仍然比野生型植株吸收了较多的Pi与L1和L8的单株含磷量分别是野生型的1.8倍和1.3倍，差异显著，但在单位干物质中的含磷量上，只有L1显著高出野生型19.0%，L8与野生型差异不显著。总体来讲，L1体内的含磷量要高于L8。以上结果表明，AVPI的超表达促进了转基因紫花苜蓿对Pi的吸收，从而使其在低磷条件下生长得更好，但转基因植株对磷的吸收能力与AVPI的表达水平是相关的。

（三）讨论

（1）AVPI超表达与转基因紫花苜蓿的离子区域化

本研究首次将拟南芥H+-PPase在紫花苜蓿中超表达，与前人在其他植物上得到的结果相一致。转基因植株的耐盐性和抗旱性显著增强；在高盐或水分亏缺条件下，野生型紫花苜蓿生长严重受抑，生物量下降，甚至死亡，而转基因植株仍然存活并能正常生长；同时，AVPI基因的表达水平同植株的抗性水平也是相关的，L1（AVPI表达水平最高）比L8（表达水平最低）表现出更高的抗逆性。Gaxiola等（2001）指出转基因植物的抗性增强很大程度上可能是因为H+-PPase的超表达提高了转基因植株的液泡膜H+电化学梯度，从而提高了包括液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白在内的二级运输载体的转运效率，将细胞质中的更多的Na+积累到液泡中，减轻了Na+对细胞质的毒害作用，并提高了液泡渗透调节能力。对紫花苜蓿幼苗叶和根中Na+积累水平的测定结果支持了以上推论。跟野生型植株相比，转基因紫花苜蓿的叶片和根系中积累了更多的Na+，说明AVPI的超表达可能增加了转基因紫花苜蓿的Na+区域化。

除了通过提高Na+区域化减轻过量Na+对细胞质的毒害外，H+-PPase的超表达还有利于细胞对其他离子，特别是K+（Gaxiola等，2001）和Ca2+（Gaxiola等，2001；Park等，2005；Zhao等，2006）的吸收，从而可以调节细胞内的离子稳态平衡，使得转基因植物在盐或干旱胁迫条件下受到较小的伤害。研究表明，K+在植物生长发育中有着重要作用，盐或干旱胁迫能降低细胞中的浓度，因而会减缓植物的生长，保持较高的胞质K+浓度，对于植物的生长及耐盐抗旱性是非常必要的（Zhu等，2001）。本研究中，不论受盐或干旱的胁迫，转基因紫花苜蓿叶和根中K+的积累量总是显著高于野生型，甚至在正常条件下，转基因植株叶片中也比野生型植株积累了更多的K+，这与许多其他的H+-PPase转基因植物的表现是一致的（Gaxiola等，2001；Guo等，2006；Gao等，2006；Brini等，2007）。可能因为液泡膜H+-PPase作为H+/K+共向转运蛋白参与K+的运输，其超表达后提高了K+的运输效率（Gaxiola等，2001）。此外，Ca2+在植物耐盐性和抗旱性方面也发挥了一系列重要的作用，如稳定细胞壁和细胞膜，刺激细胞对K+的吸收、调节水分平衡以及充当第二信使等（Yang和Poovaiah，2002）。AVPI基因在拟南芥（Gaxiola等，2001）、番茄（Park等，2005）和水稻（Zhao等，2006）中的超表达促进了转基因植株对Ca2+的吸收，本实验也得到了相似的结果：在盐或干旱的胁迫下，转基因紫花苜蓿叶片和根系中的Ca2+含量显著高于野生型植株。这可能因为AVPI的超表达为Ca2+/H+逆向转运蛋白CAX1和CAX2提供了更多的驱动力，从而提高其转运Ca2+的效率（Gaxiola等，2001）。

AVPI的超表达造成Na+区域化能力增强，使转基因植物细胞内积累更多的溶质，这些溶质主要为阳离子，这势必会降低转基因植株的渗透势，提高其保水力，从而使转基因植物在盐或干旱的胁迫下不易失水，有助于维持其膨压（Gaxiola等，2001）。本研究发现不论在正常生长条件，还是在盐或干旱胁迫条件下，转基因紫花苜蓿的叶片渗透势都显著低于野生型植株。这保证了在水分胁迫下，转基因植株叶片能比野生型植株叶片保持更多水分，从而维持其正常的膨压，提高植株的抗旱性。这与AVPI（Gaxiola等，2001）和小麦TVPI（Brini等，2007）在拟南芥中超表达、以及盐芥TsVP在玉米（Li等，2008）和棉花（Lv等，2008）中超表达的结果相一致。

根系活力是指根系新陈代谢活动的强弱，是反映根系吸收功能好坏的一项综合指标，显著受盐和干旱胁迫的影响（Zhong和Huang，2005）。在相同强度的盐或干旱处理下，转基因紫花苜蓿比野生保持了更高的根系活力，这可以确保其根系能在逆境胁迫下吸收更多的水分和养分，促进转基因植株的生长发育，从而有助于提高转基因植物耐盐性和抗旱性。将AVPI基因转入紫花苜蓿，提高了转基因植株的耐盐性和抗旱性。这是因为AVPI基因的超表达可以增强细胞Na+区域化能力，并促进细胞对其他阳离子（如K+和Ca2+）的吸收，既减轻过量Na+对细胞质的伤害，又可维持细胞内离子的稳态平衡，降低细胞的渗透势，从而保证盐或干旱胁迫下细胞内各项生理活动的顺利进行。

（2）AVPI超表达与转基因紫花苜蓿的生长发育

液泡膜H+-PPase在植物生长发育中的功能逐渐被人们发现并重视。本研究中发现无论在正常生长条件下，还是长期在盐或干旱环境中，转基因紫花苜蓿的生长状况总是好于野生型植株。2个转基因系列的根系生物量和根冠比总是高于野生型植株，这使得其在盐或干旱胁迫下生长的株高和地上部生物量均高于野生植株。值得注意的是，即使在正常浇水条件下，经过较长时间（共60天，第20天刈割1次）生长后，2个转基因系列的株高和地上部干重也显著高于野生型植株。这些结果与AVPI基因在拟南芥和番茄中超表达以及TsVP基因在玉米和棉花中超表达得到的结果是一致的。在转基因紫花苜蓿中，较发达的根系可能是植株耐盐抗旱性提高的形态学基础，对其耐盐性和抗旱性也有着重要的贡献。另外，由于紫花苜蓿属于豆科牧草，其根系具有共生固氮的特性，超表达AVPI促进其根系发育无疑为其生物固氮提供了更大的场所，这将有可能极大的提高其固氮效率，从而有助于提高其草产量。

（3）AVPI超表达与转基因紫花苜蓿的耐贫瘠性

无论有无养分胁迫，转基因紫花苜蓿的根系比野生型植株更为粗壮发达，其根系生物量和根冠比显著高于野生型植株。因此，即使在正常生长条件下，2个转基因系列就比野生型植株吸收了更多的Pi；在养分胁迫条件下，2个转基因系列比野生型植株生长得更好，其株高和地上部干重均显著高于野生型，单株含磷量和单位干物质含磷量也高于野生植株，这说明转基因植株能够从低磷环境中吸收更多的Pi，促进其地上部生长。紫花苜蓿主要生长在较为干旱的地区，土壤富含钾，但普遍缺乏有效磷。要保持紫花苜蓿人工草地的高产需要施用大量的化学磷肥，这样不仅使生产成本升高，还会对水体和环境造成污染。基因的超表达促进了转基因紫花苜蓿对的吸收，从而有望提高其在贫瘠土地上的草产量，这无疑会有巨大的应用潜力。