农林科学中有用的次生代谢产物——含氮化合物的合成

二、次生代谢产物

糖类、脂肪、核酸和蛋白质等是初生代谢的初生代谢产物（primary metabolites），农林生物体中还有许多其他有机物，它们是由糖类等有机物次生代谢衍生出来的物质，因此称为次生代谢产物（secondary metabolites）。农林科学中有用的次生代谢产物可分为植物的次生代谢产物、微生物的次生代谢产物和植物内生真菌次生代谢产物等。

1.植物的次生代谢产物

植物次生代谢产物种类繁多，结构迥异，根据其化学结构和性质，一般将其分为三大类：萜类、酚类和含氮次生化合物。而每一大类的化合物都有数千种甚至数万种以上，但其产生和分布通常有种属、器官、组织以及生长发育时期的特异性，因此往往局限在某一个或分类学上相近的几种植物种类。有些次生代谢物质为植物所共有，且为生长发育所必需；有些次生代谢产物则在植物生命活动过程中没有明显的或直接的生理生化作用，或者说迄今人们对绝大多数次生代谢物质在植物生长发育过程中是否起作用、起哪些作用尚不清楚。呼吸作用过程中的许多中间产物都可作为生物合成次生代谢物质的原料。植物呼吸代谢中PPP与莽草酸途径（shikimic acid pathway）直接相关，而大多数高等植物中的次生代谢物质都是通过莽草酸途径合成的。

（1）萜类

植物萜类化合物是由异戊二烯单元组成的化合物及其衍生物，也称为异戊二烯合物isoprenoid，或萜烯类化合物terpenoid，或萜烯terpene。目前在植物中已经发现了数种萜烯类化合物，包括由2个异戊二烯单元头尾相连形成的单萜、3个异戊烯单元构成的倍半萜，4个异戊二烯单元构成的二萜和多萜等。通常分为低等萜类和高等萜类。单萜和倍半萜是挥发性植物精油的主要成分，而植物体内释放的挥发性精油（包括异二烯本身）的量是非常惊人的。据测算，每年地球上植物释放出挥发性物质大约有14亿t，其大部分为碳氢类萜烯化合物。仅橘皮中就存在71种挥发性的植物精油，其中大部分是单萜主要是柠檬油精。最知名的一种植物精油是存在松属植物的松节油，其中含有大量的单萜类化合物。再如薄荷油中的薄荷醇、薄荷酮都是单萜的衍生物。广泛存在于针叶植物和许多热带被子植物中的树脂、橡胶都属于多萜。目前世界上发现的产胶植物大约2000种。

萜类化合物是植物挥发油、香料、固醇和植保素的组成成分；具有重要的药用价值，如红豆杉醇（taxol，亦称紫杉醇）是抗癌药物，还有人参皂苷和薯蓣皂苷等也有重要的药用价值；与光合作用、维生素A生成有关，如胡萝卜素、叶黄素；对植物有保护作用，如橡胶。

（2）酚类

酚类（phenol）广泛分布于微生物和植物体内，一般以糖苷或糖脂状态积存在于植物叶片及其他组织的细胞液泡中。有些溶于水，有些只溶于有机溶剂。酚类次生代谢物质又分为：

简单酚类、类黄酮（flavonoid）类、酚类多聚体和醌类等。简单酚类是芳香族环上的氢原子被羟基、羧基、甲氧基等取代后的产物，如咖啡酸（caffeic acid）、阿魏酸（ferulic acid）、绿原酸（chlorogenic acid）及其衍生物如植保素（phytoalexins）、香豆素（coumarins）等。类黄酮（flavonoid）类基本骨架中，具有多个不饱和键，带有多个羟基，如黄酮（flavone）、黄酮醇（flavonol）、花色素苷（anthocyanin）和异类黄酮（isoflavonoid）等。酚类多聚体是简单酚类和类黄酮类的聚合物，如木质素（lignin）、鞣质（tannin）等。醌类物质可看作是环状不饱和二酮，如苯醌、萘醌、蒽酮等。

以上这些次生物质在植物体内还具有抗病虫害入侵或吸引昆虫传粉作用。如豆科植物中的类黄酮豌豆素（pisatin）、菜豆素（pheseolin）、大豆素等都是酚类植保素，鱼藤根中的鱼藤酮（异黄酮类）有很强的杀虫作用，绿原酸、儿茶酚、原儿茶酚及醌类物质等都有杀菌作用。木质素（lignin）能增加细胞壁抗真菌穿透能力和限制病原真菌毒素向周围细胞的扩散；植物色素的主要成分，如类黄酮花色素苷参与花、果的着色，有利于传粉和传播种子。

（3）含氮次生化合物

植物次生代谢产物中有许多是含氮的，大多数含氮次生产物是从普通的氨基酸合成的。这里，着重介绍植物含氮次生代谢产物中的生物碱和含氰苷等，它们都具有防御功能。

生物碱（alkaloid）是一类含氮杂环化合物，通常有一个含N杂环，其碱性即来自含N的环。目前已发现含有生物碱的植物将近一百多个科，其中豆科、夹竹桃科、罂粟科、毛茛科、防己科、马钱科、茄科、芸香料、茜草科、石蒜科等都含生物碱。一科植物中常含多种结构相似的生物碱，如麻黄中已发现7种有机胺类生物碱。生物碱在植物体内的分布并不一致，如古柯碱（可卡因）集中在叶内，奎尼碱集中在树皮，香木鳖碱集中在种子，石蒜碱集中在鳞茎。

植物器官中的生物碱含量很低，一般在万分之几到百分之几（像金鸡纳树皮那样含奎尼碱12％是极少的）。植物在不同生长时期所含生物碱的成分及含量常有不同。有些多年生的植物，随年龄增长，某部分的含量逐渐增加，如金鸡纳树皮的奎尼碱随树龄的增长而增加，小檗根中的小檗碱（黄连素）含量也随植物年龄增长而增加。植物生物碱含量亦受外界条件的影响而改变，如氮肥多时，烟碱含量就高。

生物碱的种类很多，其生物合成的前身也不同（表7-1）。

表7-1　主要的几类生物碱

生物碱是植物体氮素代谢的中间产物，是由不同氨基酸衍生来的，尤其赖氨酸、酪氨酸、色氨酸。烟碱（nicotine）是烟草中的主要生物碱。烟碱的生物合成是由天冬氨酸和3-磷酸甘油醛合成烟酸（nicotinic acid），进一步与精氨酸生物合成的中间产物鸟氨酸（ornithine）合成为烟碱（图5-13）。

生物碱是核酸的组成成分，又是维生素B₁、叶酸和生物素的组成成分，所以具有重要的生理意义；它对动物往往有毒性，所以也有防御敌害的意义。生物碱是重要药物的有效成分，许多中药的有效成分往往是生物碱，比如有平喘作用的麻黄，其有效成分是麻黄碱；有抗菌效果的黄连，其有效成分是小檗碱；有止痛作用的元胡，其有效成分是延胡索乙素等多种生物碱。现在西药常用的重要药品，最初还是从植物分离出来证实有效后化学合成的，例如从萝芙木分离出来的利血平，从金鸡纳树皮分离出来的奎宁等。在抗癌药物中有从长春花中分离出来的长春新碱，从粗榧分离的三尖杉酯碱，从美登木分离的美登木碱等。

含氰苷（cyanogenic glycoside）广泛分布于植物界，其中以豆类、禾谷类和玫瑰一些种类最多。含氰苷本身无毒，但植物破碎后就会释放出有挥发性的毒物氰化氢（HCN）。在完整植物中，含氰苷存在于叶表皮的液泡中，而分解含氰苷的酶——糖苷酶（glycosidase）则存在叶肉中，互不接触。当叶片被咬碎后，含氰苷就与酶混合，含氰苷中的氰醇（cyanohydrin）和糖分开，前者再在羟基腈裂解酶（hydroxynitrile lyase）作用下或自发分解为酮和HCN（图5-14）。昆虫和其他草食动物（如蛇、蛞蝓）取食植物后，产生HCN，呼吸就被抑制。木薯（Manihot esculenta）块茎含较多含氰苷，一定要经磨碎、浸泡、干燥等过程，除去或分解大部分含氰苷后，才能食用。

2.微生物的次生代谢产物

抗生素在生物学上是微生物的次级代谢产物，它的产生可能作为一种防御武器，以抑制或杀伤周围别的生物体。抗生素（antibiotics）在医学上是指青霉素，链霉素等一批药物的总称。自20世纪30～40年代，人们首先从青霉菌和链霉菌发现青霉素和链霉素的医疗效果以来，至50～60年代，开展了大量的抗生素菌种的分离、培养与筛选、药物药理与临床试验及其抗生素的工业化发酵生产。迄今，已从自然界中发现和分离的抗生素已达1000余种，但世界各国实际生产和临床应用的只有100多种，还有半合成的衍生物及其盐类制品。

抗生素的生物合成，一般包括营养摄入细胞并转化为初级代谢各中间产物，合成小分子抗生素前体物质，经修饰、碳架重排等进入各抗生素所特有的合成途径，最后聚合成装配成抗生素。在一定条件下，次级代谢产物合成或装配成抗生素。在一定条件下，次级代谢产物的合成除受细胞本身的遗传调控外，还受外界环境的影响。因此，在发酵过程中，必须控制好各种因子，使产物大量积累。以下列举几例。

（1）青霉素（penicillin）

①结构与性质

青霉素是一类非常相似的三肽抗生素，含有β-内酰胺环。其功能是抑制细菌细胞壁主要成分肽聚糖的合成。青霉素的化学结构由两部分组成：一部分是带酰基的侧链和另一部是带青霉素母核，6-氨基青霉烷酸（6-APA）（图7-4）

②产生菌与发酵

工业生产上所用的产黄青霉菌（Penicillum）的某些诱变选育种，其菌种将长期保存在真空干爆的低温下。为制备大量种子（菌丝体）供大规模发酵用，一般采用二或三级种子培养。

进入大罐发酵时还要继续大量繁殖菌丝体，主要为了发酵生产青霉素，获得高的发酵率。发酵时除了注意温度、pH和溶氧之外，更要调节碳氮源的影响。试验表明在青霉素发酵时，葡萄糖迅速分解和利用，却出现减少抗生素生物合成的葡萄糖效应，其原因在于葡萄糖分解产物磷酸衍生物对AVC三肽酶（即α氨基己二酸、半胱氨酸和缬氨酸的三肽连接酶）和青霉素环化酶的抑制，使青霉素的合成受阻。但前期发酵对菌丝繁殖是有好处的。所以，青霉素发酵时可采用葡萄糖和乳糖两种碳，当第一种碳源葡萄糖耗尽时，获得了中间代谢产物和能量，再添加第二种氧化缓慢的乳糖发酵，在生产上采用玉米浆或花生饼粉成本较低，使次生代酶的阻遏解除，促进青霉素合成。

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图7-4　青霉素的化学结构

（2）头孢菌素（cephalosporin）

①结构与性质

头孢菌素C的化学结构与青霉素相似，也具有β-内酰胶环，其母核为7—氨基头孢霉烷酸（7-ACA）。它们最为重要的是合成途中具有同一的中间体，即α氨基己二酰半胱氨酰缬氨酸组成分。头孢菌素C的抗菌活性较低，经菌种筛选与化学改造，已获得高效的抗生素。

②产生菌与发酵

头孢菌（Cephalosporium acremonium）最早的医药分离效果始于1948年，直到70年代才选育出高效的生产菌株。在头孢菌发酵时，在较高葡萄糖浓度下头孢菌素C的产率下降。通过碳源流加补料发酵，可以避免这种碳源阻遏作用。头孢菌素C分子中含有硫原子，还在培养液中补给硫源，蛋氨酸是最有效的。在发酵过程中，头孢菌素C是不稳定的化合物，随着浓度的提高，非酶降解作用和乙酰酯酶的水解作用逐渐加大。另一方面，降解产物及脱乙酰头孢菌素C含量增加，又给产物的提取纯化带来不利影响。所以，从产率、产物组成、生产成本和效益等综合因素考虑，适时把握发酵终点。

（3）链霉素（streptomycin）

①结构与性质

链霉素是由链霉胍、链霉糖和N-甲基-L葡萄糖胺三部分组成。分子中含有2个强碱性的胍基和1个弱碱性的甲氨基（图7-5），因此，链霉素是一种碱性较强的有机碱，易溶于水。链霉素对不同致病菌的敏感度差异甚大，对土拉杆菌高度敏感，对结核杆菌、脑膜炎双球菌、淋病双球菌等属于中等，对白喉杆菌、大肠杆菌则不敏感。

②产生菌和发酵

链霉素生产菌种主要有灰色链霉菌（Streptomyces grisus）、比基尼链霉菌（S.bikinensis）和灰肉链菌（S.griseocarneus）。链霉素的生物合成是一个复杂的多酶生化反应，先由三部分各自合成组装，再经过脱磷酸生成。链霉素发酵控制要点：碳源以葡萄糖最合适，氮源以黄豆粉最理想；磷酸盐、和氧压是抗生素发酵时的重要调节因子。因为链霉菌的前期利用葡萄糖发酵和菌丝生长到静止时才过渡到抗生菌的合成期，方能激活关键性的合成酶，如转眯基酶。高浓度的磷酸盐加速葡萄糖的利用，菌体生长，但抑制链霉素磷酸酯酶和转咪基酶。同时通氧不足，葡萄糖降解速度加快，积累丙酮酸和乳酸。因此，链霉素的发酵需在高氧传递水平和适当低的磷酸盐浓度条件下进行。

图7-5　链霉素的化学结构

（4）庆大霉素

庆大霉素（gentamycin）是1963年由美国先令公司发现的，1965年开始应用于临床。它是由2-脱氧链霉胺、绛红糖胺和庆大糖胺组成的氨基糖苷类抗生素。庆大霉素商品主要含庆大霉素C（C₁40％、C₂35％、G_1a25％），其中毒C₁最小，C₂最大。

庆大霉素的产生菌主要是绛红小单胞菌（Micromonospora purpurea）和棘状小单胞菌（M.echinospora），后者的孢子表面有钝刺。我国于1967年分离到这两个菌种，1969年经鉴定投产并定名为庆大霉素。由于庆大霉素的发酵成品的组分使之符合临床治疗需要则是一个重要问题。所以，首先通过菌种选育，筛选出产生C₁组分多而C₂组分及其他组分小的优良菌株，或者在发酵时使用混合菌株。发酵培养基由淀粉、葡萄糖、黄豆饼粉、蛋白胨、豆油、淀粉酶等组成。在发酵过程中，需要加入适量的氯化钴和蛋氨酸、控制通氧量和发酵温度来提高发酵液中的C₁含量。

（5）四环类抗生素

①结构与性质

四环类抗生素是母核为四并苯的一族化合物，其中由微生物发酵生产的主要有四环素、土霉素、金霉素和去甲基金霉素。四环素族的化学结构如图7-6所示。其中，土霉素即5-羟基四环素，金霉素即7-氯四环素，去甲基金霉素即6-去甲基-7-氯四环素。四环素族是一类广谱、低毒、几乎无过敏性反应，口服吸收良好，成本低廉、应用广泛的抗生素。

②生产菌种与发酵

金霉素（chlortetracyline和四环素（tetracycline）都是金色链霉菌（Streptomyces aureo-faciens）；土霉素（oxytetracycline）生产菌为龟裂链霉菌（S.rimosus），它们在50年代分离出来，经过长期时间的菌种筛选和工艺条件的优化，发酵单位已达到30000U/ml水平。发酵培养基常用碳源为淀粉、葡萄糖、糖蜜和油脂等。氮源为花生饼粉、黄豆饼粉、玉米浆、脲素、硫胺等。四环素发酵需添加抑氯剂溴化钠和2-巯基苯骈噻唑及其微量硫氰化苄（BTG）可提高四环素产率。

图7-6　四环类抗生素化学结构

（6）红霉素（erythrornycin）

①结构与性质

红霉素是由红霉内酯环、红霉糖和红霉胺3个亚单位构成的大环内酯抗生素。由同位素示踪和突变株研究揭示的红霉素的生物合成反应程序是：丙酰辅酶A与六分子的α-甲基丙二酰辅酶A缩合产生多-β-酮中间体，经若干修饰得6-脱氧-红霉内酯B，在C₆羟基化作用后得红霉内酯B，发生由αdTPP-L-红霉糖转L-红霉糖基于内酯环的3位羟基，而红霉氨糖结构部分转移至C₅羟基后得红霉素D。红霉素D是代谢的一个分支点，甲基化后得红霉素B，在C₁₂羟基化可成红霉素C，再甲基化则生成红霉素A。所以，在发酵液中含有红霉素A，B，C，D等组成分，其中以红霉素A为主要组成分，且以A抗菌活力最强，因此，临床上使用的是红霉素A及其盐类。

②生产菌种与发酵

红霉素是1952年从红色链霉菌（S.erythreus）培养液中分离的一种抗生素。有研究表明，红霉素高产株对正丙醇的利用率比低产菌株高4～5倍，并且对正丙醇的利用速度和红霉素的生成速度都较快，能使约45％的正丙醇结合到红霉内酯结构中，而低产菌株只能结合15％。这对选育红霉素高产菌株的工作很有参考价值。

红霉素的发酵培养基成分由淀粉、葡萄糖、黄豆饼粉、玉米浆、硫酸铵、磷酸二氢钾和碳酸钙组成。但在发酵过程中加丙酸或丙醇作为前体以提高红霉素A的产量。每分钟发酵通气量的体积一般为1：1，发酵温度为31℃，pH在6.6～7.2；同时还要控制还原糖的含量在1.2％～1.5％，每天补加一定的葡萄糖和有机氮（本节参阅姚汝华（1996）、杨汝德（2001）等工业微生物之书）。