微藻光合放氢与细胞工程制氢的研究成果

二、微藻光合放氢与细胞工程制氢

1.微藻光合产量原理

微藻（microalgae）通常指蓝藻和绿藻，一般具有比较完整的光合作用系统，其水光解放氢可以分为两个步骤。第一步微藻通过光合作用系统Ⅱ（PSⅡ）光解水，产生质子、电子，并释放氧气，反应可表示为：

第二步蓝藻通过固氮酶系和绿藻通过可逆产氢酶系，还原质子为氢气。蓝藻及其他固氮微生物主要利用固氮酶把氮气转化为铵（NH₃），其中通过固氮酶的电子有25％用于还原质子释放氢气，形成1mol氢气需要16molATP，反应式如下：

N₂＋8H^＋＋8^e-＋16ATP 2NH₃＋H₂＋16ADP＋16Pi

可见，此过程不但消耗ATP，而且产氢的质子利用率只有固氮反应的1/4，所以制氢效率较低。然而，在厌氧光照下，绿藻的可逆产氢酶还原质子产生氢气，反应如下：

2H^＋＋2e^- H₂

微藻细胞中参与氢代谢的固氮酶、吸氢酶和可逆氢酶。酶均存在于蓝藻中，而绿藻中则只发现有可逆氢酶。在蓝藻和绿藻中，电子在传给Fd后可能不传给NADP^＋，而传给H^＋并将其还原为H₂，Red为氧化还原酶联接呼吸代谢、三羧酸循环和糖酵解产物氧化还原的电子传递（图6-12）。可逆产氢酶制氢的电子来自PSⅡ光解水，再通过质体醌（PQ）、细胞色素b/f、PS1、铁氧化还原蛋白（Fd）到产氢酶，还原质子产氢（图6-12）。氢酶不仅存在于绿藻中，同时也广谱分布在所有的细菌中，按其所含金属离子的不同可以分为铁氢酶、铁镍氢酶和不含金属离子的氢酶三种。按其作用机理又可以分为吸氢酶和可逆产氢酶两种。

2.微藻生物产氢研究进展

蓝藻（Anabaena cylindnca）具有光系统Ⅰ和Ⅱ，水是最终电子供体。因此，产氢所需的质子和电子来源于水的裂解，氢氧的产生密不可分。因蓝藻含有异形细胞，具有保护固氮酶在氧气环境中不失活的机制，继续进行固氮放氢。Mitsui等人（1974）广泛地筛选了产氢效率高的蓝藻，获得单细胞固氮蓝藻株系，利用同步培养技术保护和提高固氮酶活性，在低光照条件下，使用波长在400～700nm范围内的可见光源，可以得到3.5％的光能转换效率。从理论上讲，蓝藻固氮酶产氢，由于大部分能量消耗于固氮反应，所以固氮产氢的能量利用率难以有较大提高。

目前正在研究的绿藻可逆产氢酶光解产氢主要有三种方式：直接水光解产氢、一步法间接水光解产氢以及两步法间接水光解产氢。(www.xing528.com)

图6-12　绿藻产氢时氢酶的相关电子传递途径

绿藻可逆产氢酶水光解产氢是在厌氧等胁迫条件下，利用绿藻体内的可逆产氢酶电子传递途径产生氢气。由于绿藻体内没有固氮酶活性表达，其理论产氢速度和光能利用效率都比蓝藻高。但是，可逆产氢酶对氧气极为敏感，当气相环境中氧气浓度接近1.5％时，可逆产氢酶迅速失活，产氢反应立即停止。所以直接水光解产氢过程难以继续进行，难以发展为大规模的制氢技术。

间接水光解制氢可以实现O₂和H₂的产生在时间上或空间上分离。绿藻在不含硫的培养基中，光合作用放氧能力逐渐降低到小于呼吸作用的耗氧能力，使藻液保持厌氧状态，产氢酶表达水平高，放氢时间延长，产氢量显著提高。间接水光解产氢有两种工艺路线。Greenbaum（1982）提出一步法间接水光解工艺，将藻细胞悬浮在无硫的培养液中，在厌氧条件下3h以诱导可逆产氢酶的表达，然后光照下绿藻细胞为了维持自身的生命活动，消耗体内营养物质，产生的电子通过电子传递链传到可逆产氢酶还原质子产氢，得到的气体含有H₂、O₂和CO₂，证明此过程与细胞体代谢有关，不能使氢气、氧气的产生完全分离。

美国国家可再生能源实验室（2000）开发的两步法间接水光解制氢工艺是：第一步，将衣藻（Chlamydomonas reinharadtii）进行正常的光合作用，固定CO₂，释放氧气，积累有机物；第二步，在无硫、厌氧的环境中诱导该衣藻可逆氢酶的高表达，再光照消耗细胞代谢物质产氢。该系统用3×10⁶～6×10⁶Cells/ml的藻液每小时产氢2.0～2.5ml的速度延续了70h，气体的组成为87％的氢气，其余是N₂、CO₂和O₂。

3.微藻细胞工程制氢技术

所谓微藻细胞工程制氢，是指微藻单细胞藻种经过人工改造与筛选而进行藻细胞液体工艺培养达到有效制氢的一种工程技术。国际能源组织（IEA）的评估报告指出，微藻水光解制氢的光能利用率必须接近10％才有实际应用意义。当前，大部分微藻只能捕获3％～4％的太阳能。所以，微藻可逆产氢酶制氢技术实用化的关键性课题包括以下三个：①优质产氢藻株的筛选与基因工程改造。②高效培养和产氢生物反应器的构建。③制氢系统经济评价研究。

优质的产氢藻种既要求产氢效率高，还要求耐受高的氧气浓度。多年来，科学家在藻种的筛选方面作了许多工作，例如Carrasco等对编码氢酶大亚基的HupL多肽合成的HupL基因操纵子DNA片段在鱼腥突变体7120异型胞进行重组，得到了鱼腥藻（Anabaena Pcc 7120）吸氢酶缺失突变株AMC414，其放氢活性也得到显著提高。但由于放氢调空机制还未完全阐明，因此进行分子改造程度有限。在培养技术上，可通过减小微藻集光色素尺寸，增加光在藻液中的透光度，使光合作用效率和产氢效率提高。

所以，在两步法间接水光解制氢过程中，高效廉价的光生物反应器的开发是微藻逆产氢酶水光解制氢实用化的另一个重要课题。包括光生物反应器的设计、优化、构建和操作等内容。微藻水光解制氢的反应器系统应该包括微藻的高密度培养、产氢酶的暗诱导和光照产氢三部分。通过对藻株、微藻浓度、产氢速度、光的衰减、循环时间以及培养池深度等因素的研究，发现在高日照地区（每日每平方日照21兆焦）可以获得10％的太阳能转化率。以此为基础，IEA1998年对一反应器微藻间接水光解制氢的工艺分析和成本测算说明，不计算气体纯化、存储的费用，氢气的成本大约为15USD/GJ。这些年，Ghirardi等（2000）采用两步法间接水光解制氢工艺，在实验室低光照条件下，一种衣藻把22％的光能转化为氢能，也就有可能达到10％的太阳能转化效率。如果能在室外太阳光照下获得结果，微藻水光解制氢有望实用化。由此，预测氢气的成本降至10USD/GJ，从而有可能达到市场可接受的生产成本。