生物固氮基因工程：利用植物细胞实现固氮能力转变。

二、生物固氮基因工程

生物固氮研究的最终目的，是将固氮基因转到高等植物，从而实现谷物生产不依赖于化学肥料的理想。一般细胞要从遗传上转变为具备固氮能力的特殊细胞，必备4个条件：①固氮菌的全部nif基因都能在同一个植物细胞中表达；②固氮酶复合体能够加工和组装；③具有厌氧环境；④提供ATP和NADPH能量。通过近些年的探索，可归纳为三方面的途径：

1.使根瘤菌感染非豆科植物结瘤固氮

Trinick（1987）发现，根瘤菌能在非豆科植物Paraspom ia上结瘤固氮，其根瘤中有类似于Lb的血红蛋白存在，其基因结构与豆科植物的Lb基因相似，并高度同源。非豆科植物是否存在类似豆科的结瘤素及其表达基因，尚无肯定意见，但有人已经尝试根瘤菌在水稻等植物上结瘤。虽然没有能够检测到固氮活性，但试验表明用细胞学和分子生物学检测使根瘤菌进入非豆科植物，扩大其宿主范围是有可能的。据潘建菁（1998）报道应用Frankia菌接种水稻和玉米在2，4—D诱导下植株根部出现瘤状突起，经测定具有与根瘤菌相似的乙炔还原活性。

2.根癌农杆菌的介导载体作用(https://www.xing528.com)

根癌农杆菌和根瘤是亲缘相近的一种土壤细菌，能感染双子植物并引起根部形成肿瘤，称根癌（crown gall）。根癌农杆菌含有Ti质粒和其所含T-DNA特性，已引起人们极大兴趣，认为这是植物遗传工程中的一种很有希望的载体，试图让这种细菌的Ti质粒携带nif基因进入高等植物细胞。首先将nif基因转移到不固氮的大肠杆菌中，目前技术已有可能；第二步将大肠杆菌中的nif基因转移到农杆菌中，也有可能实现；第三步以农杆菌为载体将nif基因转移到植物细胞中进行表达，虽有难度，但也已取得一定进展。

3.以叶绿体作为载体

叶绿体作为固氮基因载体的理由有：①叶绿体的基因较小，易于体外基因重组；②叶绿体的蛋白质合成机制近似于原核生物，有利于原核DNA在其分子中克隆；③叶绿体含有大量ATP和NADPH提供固氮。这种可能是用带有nif基因的质粒转化植物细胞的叶绿体，从而使正常的原核信号进行表达，而不必将17种nif基因置于植物细胞核启动的控制之下。我国张中林（2001）等进行了固氮酶铁蛋白nif基因在高等模式植物烟草叶绿体中表达的研究。这项先期探索性工作主要包括两部分，通过质粒构建与载体转化来验证单子叶水稻叶绿体PSbA基因启动子和终止子的克隆与功能，并观察固氮酶铁蛋白nifH基因在叶绿体中的表达及抗性基因在叶绿体转基因植株后代中的遗传规律。实验已经论证固氮酶nifH基因在高等植物叶绿体中，得到初步表达。然而，固氮酶的氧抑制作用仍然是一个难以解决的问题。因而，这是一项十分复杂而艰巨的工作。