根瘤菌固氮基因的表达与调节机制及其协同作用

一、固氮基因

1.肺炎克氏杆菌的固氮基因

肺炎克氏杆菌是兼性厌氧自生固氮菌，只在无化合态氮和无氧的条件下才能进行固氮生长；在有氧和有铵时能快速生长，但不固氮。Kp的固氮基因（nif）位于染色体上，介于组氨酸合成酶基因hisG和莽草酸合成酶基因shiA之间，全长23Kb，有20个固氮基因，分属于8个转录单位，紧密排成一簇（Merrick，M.J.1988），如图5-6所示。

图5-6　肺炎克氏杆菌nif基因簇的结构

在这20个固氮基因中，转录单位nifBQ中nifB与运输Mo有关；nifLA分别是负调节基因和正调节基因；nifF编码黄素蛋白（电子递体）；nifUSVWZM转录单位中的nifU和nifS与合成Fe-S原子簇有关。再者，nifENX中的nifE和nifN与合成FeMo-Co有关，而nifX的功能尚不清楚。nifHDKTY中的nifHDK是编码固氮酶蛋白的结构基因，分别编码Fe蛋白和MoFe蛋白，nifT的功能尚不明白，nifY与FeMo-Co向MoFe蛋白插入有关。nifJ编码丙氨酸—黄素蛋白氧化还原酶，负责电子传递，它和nifF的转录方向一致，和其他转录方向相反（图5-7）。

2.根瘤菌固氮基因

根瘤菌除具有和自生固氮菌相同的一些nif基因外，还有与宿主共生形成的结瘤基因（nod）和固氮基因（nif/fix）。而nif/fix和nod基因一般是成簇分布在染色体上，但少数根瘤菌的结瘤和固氮基因却位于染色体外大质粒上。然而，不同根瘤菌的结瘤基因的组成和结构有共性也有个性。如某些豆科结瘤基因在不同种或亚种之间，可以互换而不改变结瘤功能的，称为共同结瘤基因（nod）。另一些结瘤基因为特定的宿主结瘤所必需的，称为宿主专一性结瘤基因（hsp）。图5-7所示为三种有代表性根瘤菌的结瘤基因簇。它们是：①豌豆根瘤的蚕豆变种（Rizobiumlegum inosarum by.viciae）；②苜蓿中华根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）；③大豆慢生根瘤菌（Brady rhizobium japocum）。

图5-7　三种根瘤菌的结瘤基因簇(www.xing528.com)

（引自莽克强 农业生物工程，2004）

nodABC是所有根瘤菌共有的。大多数根瘤的nodABC组成一个转录单位，其表达产物参与结瘤因子的合成。nodABC和其nod基因的表达受调节基因nodD的调节。nodD的表达活性产物为类黄酮物质。nodD普遍存在于根瘤菌中，有些根瘤菌的结瘤基因簇中只有一个nodD而有些则有2～3个。如nodD发生灾变，会失去结瘤能力。

近些年来，我国学者对根瘤菌固氮基因的调节与表达也有所研究。例如赵洁平（2001）将肺炎克氏杆菌（Kp）的nifA基因导入大豆根瘤菌Sinorhizobium f redii HNOI，结果发现Kp nifA基因既可提高大豆根瘤菌的结瘤活力和竞争结瘤能力。这为nifA基因是nif/fix基因的正调基因提供了新的证据。李友国等（2000）将苜蓿根瘤菌（S.meliloti）的dctABA基因导入大豆慢生根瘤菌（Brady rhizobium japonicum），结果发现大豆慢生根瘤菌的固氮能力显著提高，而转化大豆地上部分干重和总氮量明显高于对照。由此可见，通过重组DNA的遗传操作可提高根瘤菌的共生固氮能力。

3.弗氏固氮基因

非豆科弗氏菌结瘤共生固氮基因除已知的结瘤基因和固氮基因外，还有谷氨酰胺合成酶（GS）基因。固氮基因包括nifH、nifD、nifK、nifA、nifB、nifX、nifW、nifZ、nifV、nifE、nifU、nifS和一些orf基因。谷氨酥酰胺合成酶是把FranKia菌固定的氮素同化物转移到植物体内的一种酶，并已从弗氏菌中分离到2个编码GS基因的glnA和glnⅡ。

nifH、nifD和nifK基因是分别编码弗氏菌固氮酶的Fe蛋白和MoFe蛋白的结构基因，3个基因连锁成簇状排列在染色体上，但不同菌株之间nifH和nifD及nifDTnifK之间序列在长度和同源性上差异较大。nifA是正调节基因，在Frankia Eulkl菌株中还发现2个nifA基因，nifA₁和nifA₂的完整核苷酸序列长度分别为1926bp和1524bp。在弗氏菌与非豆科木本植物结瘤发育过程中也产生一些专门的血红蛋白和结瘤素，这些蛋白质的基因在结瘤中顺序表达协同固氮基因，完成共生固氮。一般把宿主植物的基因编码的根瘤特异性蛋白统称为结瘤素，编码这些物质的基因叫结瘤基因。目前已对木麻黄和赤杨根瘤中相关的nod基因、血红蛋白cDNA克隆及根瘤特异蛋白cDNA克隆进行了研究。

Jacobsen-Lyon等（1995）从木麻黄根瘤cDNA表达文库中分离到3个共生血红蛋白cDNA克隆，这些cDNA克隆属于一个基因家族（Cashb-sym），有90％的氨基酸序列相同。它们仅在根瘤组织中表达。他们还鉴定出2个共生和非共生的木麻黄红血蛋白的启动子区，并在一个转基因Gus融合的Lotus系统中检测其活性。Cashb-sym启动子区含有豆血红蛋白结瘤素box共同序列AAAGATn 6CTCTT的几乎全部拷贝（AAAGATn 7CTCTT），木麻黄属植物根瘤血红蛋白及其基因序列与大豆的一个新血红蛋白基因的同源性为85％～87％。CHGuan等（1997）已从赤杨根瘤cDNA文库中分离到富含谷氨酸和脯氨的cDNA克隆PAg13，此外，类似许多编码与结瘤有关的氨基酸蛋白酶、合成酶基因得到克隆。

4.类芽孢菌固氮基因

类芽孢菌属（Paenibacillus）是1993年从牙孢杆菌属（Basillus）中分离出来的新属。这两属中都包括一些固氮的种类。2003年Choo首次报道P.azotofixans中有3个拷贝的nifH，即nifB₁H₁D₁K₁，nifB₂H₂和nifH₃。该研究虽然确定了nifB₁H₁D_iR_i连在一起，但其中的nifB₁和R_i都是部分基因，其上下游的序列还没有获得。我国赵洪新等（2005）分离得一株产芽孢的固氮菌P.massiliensisT₇，采用反向PCR法获得了PurD，nifBHDKEN基因和部分nifX。这也是在Paenibacillus中有关完整与nifHD相融合，研究了在不同铵和氧的条件下β-半乳糖苷酶的表达情况，这些结果为探索类固氮芽孢菌的固氮机制提供了调控因子。