转基因动物：小鼠到鱼、鸡的转变

四、转基因动物

1.转基因方法

转基因动物（transgenic animal）是指体内基因组中稳定地整合有外源性基因的动物。转基因动物最先始于小鼠试验，人们将各种基因转入小鼠，为了解高等动物基因表达调控肿瘤发生、胚胎发生等基础生物学研究，作出了重要贡献，而今得到广泛开展。

转基因技术就是将外源DNA直接导入受精卵的原核或细胞中，显微注射法或逆转录病毒法最为常用，此外，还有介导法、载体法等。它们各有优缺点。在用受精卵显微注射法时经常发现一些子代会出现与外源基因功能无关的某些特征，这是由于外源基因整合时引起整合位点处内源基因的插入突变所致。在外源基因整合率上，小鼠、家兔、牛、猪和绵羊分别为17.3％、12.8％、3.6％、9.2％和8.3％（以移植产下的原代活仔畜计）。

目前，人们通过多种方法比较，认为在育成能够整合表达外源基因的转基因动物广谱性方面，显微注射技术仍不失为最经典最有效的途径。逆转录病毒基因转移法（retrovirusmediated gene transfer）是利用逆转录病毒作为载体进行基因转移，如图4-24所示。Moloney小鼠白血病毒（MoMul-V）是一种RNA逆转录病毒，通过逆转录酶产生的原病毒DNA的单一拷贝可以整合到转染细胞的染色体位点上，不会发生寄主基因组大规模的重排，只有整合位点上的很短一段寄主DNA顺序产生重排。有试验证明病毒转染的小鼠胚胎可发育成携带病毒基因的小鼠，并按孟德尔规律遗传给子代。但MoMuL-V可以在成年小鼠体内重新被激活并使小鼠生白血病。

2.转基因鱼类

鱼类是脊柱动物中较原始的类群，从多倍体和雌核、雄核发育较易成功来看，鱼类的遗传可塑性很大。早在1980年，童第周的鲤鲫核质杂种鱼的培育成功也说明了此观点。90年代，各国研究者在构建全鱼基因（all fish gene）方面，取得很大进展，转生长素（growth hormone，GH）基因研究是个热点。原因如下：①鱼是人类主要蛋白质来源之一，对培养生长快、产量高的“超级鱼”有很大的诱惑力；②受超级小鼠诞生和猪、兔、羊的转基因效应的鼓舞；③很多动物GH基因序列都已搞清楚，被克隆，并用DNA重组技术构建了许多含有小鼠重金属结合蛋白（mousemetal thionein，mMT）启动子，mMT的GH基因质粒，这为各种动物基因转移的研究准备好了现成的“导弹”。

因此，把GH基因向鱼类转移作为第一个主攻方向是很显然的，但这几年的努力，有实用价值的“超级鱼”目标还难以实现。如使用mMT启动子构建的转基因虹鳟，未见有表达；使用鳟鱼（trout）的tMT启动子，在鳟鱼肝脏培养细胞中mMT的表达比tMT的表达小20倍。这几年，沈孝宙领导的研究小组从事鲤鱼MT启动子的克隆研究。他们用Cd和Cu离子诱导转mMT-h GH基因鲤鱼，也未见增强表达作用；随后用草鱼肾细胞证明SV40启动子CAT（氯霉素已酰化酶）基因有很强的作用。如此许多试验表明外源基因在细胞质里的非整合表达，不很成功或即瞬时表达。看来从鱼类本身GH基因的启动序列和增强序列来作启动子，是解决启动子问题的最终方案。

图4-24　逆转录病毒基因转移法

所谓全鱼基因，是指基因的启动子和结构基因都来自鱼类本身（可以是不同种）。现在，鱼类GH基因已从大马哈鱼、虹鳟等中克隆出来。在我国，朱作言实验室于1985年首先完成了生长激素基因的研究，此后又完成了转草鱼基因（即全鱼基因）的鲤鱼工作。沈孝宙实验室已克隆了大麻哈鱼GH基因。Du等（1992）首次用全鱼基因向鱼类转移已获得成功。他们使用了AFP基因启动子和鲑鱼生长激素基因（sGH），并发现AFP启动子对sGH基因有很强的启动作用，转基因鲑鱼的生长速度比对照鱼快4～6倍。这项成果标志着第2代转基因鱼已经诞生。抗冻蛋白（AFD）基因是从北极一种鱼类中克隆的基因，我国也在研究。这为向不抗冻鱼类转入AFD基因，以提高抗冻性是很有前景的。近几年来，朱作言实验室的转基因鱼在生长激素和腺性发育调控等方面取得了进展，而沈孝宙实验室在进行转基因鱼外，还开展了禽蛋转基因研究。(www.xing528.com)

3.转基因鸡

多数转基因动物都是通过显微注射外源基因受精卵雄核的方法获得的，包括转基因小鼠、兔、羊、猪等。但鸡卵原核较小，又被不透明的细胞质遮盖，不易观察，而且同时出现许多超数原核，无法区别，因此，难以注射原核。1991，Perry在体外将外源基因注射到单细胞受精卵细胞质内，经过体外培养后，成功地生产出转基因鸡。自此以后，许多工作者对外源基因的注射和培养技术有所改进而得到提高。如Lnada等（1997）注射标记基因MiwZ到受精卵胚盘中，经保温到14期胚胎，57％胚胎内外组织转录MiwZ，其中9％胚内组织表达转基因。

逆转录病毒是一类通过DNA进行复制的RNA病毒。在正常生命周期中，逆转录病毒整合到宿主染色体内，成为前病毒。携带外源基因的重组病毒感染鸡胚中多能的胚层细胞，这是简便有效的转基因方法。选用无内源相关病毒和未经外源病毒感染的母鸡所产的蛋，保温前在大头壳中开孔，将重组病毒注射到胚层下胚腔中，病毒感染外胚层的原生殖细胞后就获得嵌合体转基因鸡，然后培养成半合成纯合转基因鸡家系。当然，逆转录病毒载体法的优点是操作简易，转基因成效高，但缺点是如果与野生型病毒重组后，则有致病危险。

精子作为基因转移载体亦是有效简便的。具体途径可分2种：其一是先通过辐射灭活的精液法将特异的标志基因带入卵，然后第2次受精，其后代会获得可表达的外源基因。其二是通过外源基因与精子一起孵育，使DNA吸附于精子头部，再进行受精。用此法已产生出转基因鱼、转基因鸡等。应用脂质体介导DNA与精子融合法的普遍有效性尚有争论，但它比转录病毒介导法安全，是值得深入探索的方法。

转基因鸡的多种方法还在实验之中，有其广阔的应用前景。其主要是：提高肉蛋的质和量，生产医用和保健蛋白并控制疾病。

4.转基因哺乳动物

近些年来，转基因动物在哺乳动物中已得到应用，如牛、羊、猪、兔、和猴子等。从总体上说，科学家把外源的DNA转入受精卵内，经过筛选发育那些体内带有外源遗传物质的动物就是转基因动物。转基因动物的工作除了获得优良的动物品种之外，还有作为基因治疗研究试验。

转基因哺乳类动物采用生殖细胞、受精卵注射是简易可行方法。第一个转基因动物是接受生长激素基因的小鼠，其体内的激素水平明显提高，体形也特别大，这种遗传性状能传给它的子代。如果将动物生长激素基因导入由于缺乏生长激素而生来矮小的小鼠的受精卵中可以治愈这种矮小病症而得正常大小的小鼠。

为了改良品种的目的，接受了牛的生长激素基因的猪在接连几代都有良好的表现，例如在每日体重增加和饲养效率上都超过对照组，脂肪也明显减少，早在20世纪90年代，我国的转基因猪筛选出10％以上良种进行繁殖，获得多代转基因猪数百头，核心群体生产水平比对照高20％，为转基因猪的商品化打下了基础。据桑润滋（2006）报道，目前华北农区牛的胚胎移植正向产业化迈进。截至2005年7月，累计移植高产奶牛胚胎12000余枚，鲜胚移植妊娠率达55％以上，冻胚移植妊娠达40％，其中用性控胚胎移植受体1882头，妊娠率达35％，对已产犊的258头犊牛性别统计，母犊率为94.96％。

转基因工程还可以把牛羊的乳腺作为生物反应器，生产药用蛋白，如含有干扰素、抗胰蛋白酶、抗凝血酶等乳液成分。这种设想在20世纪末已由国内外某些生物工程公司提出，在试验中已取得初步效果。例如英国PPL公司曾装备了一个实验车间来研究从羊奶中提取AAT。实验证明按照制酪工业的工艺，将奶中脂肪和酪蛋白除去以后，用工业层析技术就可以将产品提纯。这远比从微生物发酵工艺中提取产品要收集菌体、进行破壁和除去大量蛋白质简单得多。据我国2000年12月新闻报道，北京某生物科技中心首例成功地获得三头转基因羊，它们身上转有人的抗胰蛋白酶（mAAT）基因，期待母山羊产下的奶将成为肺气肿等肺部疾病的特效药。这无疑是一项很有价值的研究。