PCR测序的引物设计和反应温度条件的影响

五、PCR测序

PCR技术自1985年建立以来，由于快速高效地扩增DNA片段的作用，在分子生物学研究中得到广泛应用，也可用于测序。

1.PCR直接测序

PCR直接测序是指对PCR产物进行的直接序列分析，而不需要先将DNA待测片段克隆于测序载体上，这不仅大大地简化了操作步骤，而且可实现自动化操作。PCR产物测序常采用循环测序法；在PCR反应体系中将ddNTP加入（即双脱氧链终止法），并利用同位素或灾光素标记的引物引导扩增，使模板的扩增与测序同时进行。这种测序方法，模板量小、简便，易自动化，测序效率高。然而，在测序PCR扩增反应中，所设计的引物和反应温度条件对测序PCR的结果影响较大，这是操作者极需注意的。(www.xing528.com)

2.PCR寡核苷酸探针斑点杂交（PCR-Asb）法

如果一个基因的突变部位、性质经测序分析已经阐明，即可用该方法直接测查突变。该方法的原理即利用人工合成的寡核苷酸片段作为探针，与经PCR扩增获得的靶DNA进行杂交，在严格控制杂交条件下，通过斑点杂交或其他类型杂交来检测PCR产物中有无相应的突变，即探针与靶DNA片段之间只要有一个碱基不配对或错配就能检出。

综上所述，DNA测序是一项比较复杂的生物技术，无论手工测序还是测序仪自动测序，都会遇到各类问题。譬如测序结果信号弱，无法正确读取序列；信号模糊或信息提前终止，测序反应无法继续进行，甚至还会出现无正常测序信号。这些现象出现不足为奇，只有专门研究人员才能开展工作，找到各种原因，获得有效的测序。