DNA杂交测序技术：从探针与靶DNA杂交到核苷酸序列分析

四、DNA杂交测序

1.原理

杂交测序法（sequencing by hybridzation，SDH）是借助于芯片技术而产生的一种全新的DNA测序法。在一个玻璃或硅片上合成大量已知序列的寡聚核苷酸片段作为探针，其一端固定在固体基质上，另一端是游离的。它们在硅片（即芯片）上有规律地排列着，每个特定位置上探针的序列都是已知的。假如有一个DNA片段需要测序，我们可以把它的单链形式用荧光进行标记，然后与硅片上的6万多种探针进行分子杂交，在荧光显微镜下观察杂交结果。

如果某个探针与待测DNA某个部分的序列是完全互补的，待测DNA分子就被结合到硅片上，这个探针所在的位置就会发出荧光。若一段较短的DNA探针能够同较长的靶DNA片杂交，并形成双链结构，以此推断在靶DNA上存在着相应的互补序列。如果将一种核苷酸顺序为5′-AGCCTAGCTGAA-3′的12-mer的靶DNA，与一组完全随机的8—mer寡核苷酸探针混合杂交，在总数为4⁸＝65536种的8-mer探针群体中，仅有5种会与靶DNA形成完全互补的双链分子。根据这5种发生了完全杂交作用的8-mer寡核苷酸探针之间重叠序列的线性关系，便可推算出这段12-mer的靶DNA分子的核苷酸循序（图4-23）。

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图4-23　最简单的杂交测序原理

2.测序步骤

首先将测定的靶DNA分子同一组已知其核苷酸顺序的寡核苷酸探针进行杂交，然后与那些能够同靶DNA形成完全的双链杂合分子的寡核苷酸探针做比较分析，并推算出靶DNA的核苷酸序列。其主要操作过程：①DNA测序芯片的制备，一种方法是在芯片载体上直接原位合成，另一种方法是将事先合成好的探针通过喷射或直接接触，固定在带有特定活化基因的芯片载体上。②将待测定的靶DNA分子进行荧光标记。③将带有荧光标记的靶DNA分子与DNA测序芯片上的探针进行杂交，杂交后进行清洗。④使用激光共聚焦扫描仪结果进行荧光检测，得到杂交结果图。根据能够同靶DNA完全杂交的寡核苷酸探针之间的碱基重叠关系，通过专门的计算机分析软件处理得出待测DNA分子的核苷酸序列。