Sanger双脱氧链终止法得到不同终止的放射性互补链混合物

一、Sanger双脱氧链终止法

1.原理

双脱氧链终止法由英国剑桥大学F.Sanger等人于1977年发明的。它主要利用DNA聚合酶具有双重催化活性来操作的。第一，DNA聚合酶能够利用单链DNA作模板，合成互补链cDNA；第二，DNA聚合酶能够利用2′、3′—双脱氧胸腺嘧啶核苷三酸磷（ddTTP）作底物掺入寡核苷酸链的3′端，取代了脱氧胸腺嘧啶核苷三磷酸（dTTP）之后，由于ddTTP没有3′—OH基因，所以寡核苷酸链就不能再继续延长，即终止了链的合成，于是在本应由dTTP掺入的位置上便发生了特异性的终止。这样，可调节双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）和脱氧核苷三磷酸（dNTP）的比例，从而获取良好的电泳谱带模式以便于读取核苷酸序列。

2.测定步骤

以M13噬菌体为载体的双脱氧链终止法的实施为例（图4-19）。其主要步骤操作：

（1）将待测序的DNA片段克隆于M13mp系列载体的特定酶切位点，并以相同限制酶切割M13噬菌体复制型双链DNA（RFDNA）。(www.xing528.com)

（2）将待测外源DNA片段与M13RFDNA连接，转化筛选出阳性重组噬菌体。已知平板上的每个白色噬菌斑是由一种重组M13DNA分子转染细菌后产生的，如果取一个白色噬菌斑进行培养便可得到一种单链形式的DNA。

（3）利用DNA合成仪合成一段与待测DNA片段3′端互补的核苷酸引物。

（4）将待测单链DNA模板与寡核苷酸引物混合，引物与DNA单链模板3′端进行杂交，并把杂交混合物分为四份，每份中均加入等摩尔量的四种dNTP，其中一种用放射性标记（通常用α—³²P-dATP），此外，还需分别加入一种双脱氧核糖核酸（ddATP、ddGTP、ddCTP、ddTTP），四管中的ddNTP均不同。这样在加入DNA聚合酶反应数分钟后在适当温度条件下延伸互补链，就可得到四组分别以A、G、C、T终止的长短不一的放射性标记的互补链混合物，其范围从几个碱基对至200bp左右。

（5）将以上四种含有长短不等的反应混合物在同一聚丙烯酰胺胶板上进行电泳，即可把相差一个核苷酸的寡核苷链分离开，自后凝胶干燥，可得到放射自然图谱，并能直接读出核苷酸的排列顺序。