基因文库的构建和筛选方法

二、基因文库的构建与筛选

根据基因类型，基因文库可分为基因组文库（genomic librarg）和cDNA文库（cDNAlibrary）。

1.基因组文库

基因组文库是指将某生物的全部基因组DNA切割成一定长度的DNA片段克隆到某种载体上而形成的随机克隆群。基因组文库根据DNA来源又有核基因组文库，叶绿体基因组文库及线粒体基因组文库。

基因组文库构建过程一般分为4个步骤，如图4-13所示。

图4-13　噬菌体载体构建基因组文库克隆过程

（引自驾淹才：简明基因工程及原理，2005）

（1）DNA片段的制备：从生物组织中分离的基因组DNA，用限制性内切酶进行分解。分离出大小合适的那部分DNA片段，这需要掌握酶的保温与作用时间，以琼脂糖凝胶电泳寻找最佳的降解DNA片段。将溶解物分级分离（如用蔗糖梯度分级分离法、凝胶电泳法），除去太大的及太小的片段，收集合适长度片段（如3000bp），进行下一步载体的连接。

（2）DNA片段与载体的连接：常用λ噬菌体DNA作载体，它既有较高的克隆效率，又可容纳较大的外源DNA片段。常用T₄DNA连接酶把DNA片段与载体相连。

（3）重组体转化与克隆：将重组体细菌细胞体外包装λ噬菌体进行感染或转化使质粒DNA进入细胞。

（4）筛选鉴定基因组：由于基因组文库包含了染色体的所有随机片段形成的重组DNA克隆。因此，利用适应的鉴定和筛选方法，如目的基因DNA片段在不同克隆中被大量扩增时，只要加入某一基因探针，则容易从众多克隆中筛选出所需要的目的基因片段的重组克隆。

2.cDNA文库的构建(www.xing528.com)

cDNA文库是指某些生物某一发育时期所转录mRNA经反转录形成的cDNA片段与某种载体连接而形成的克隆集合体。通过筛选可以直接获得编码区序列，因为不含5′端调控序列和内含子，显得“纯净”，这是它的一个优点。

图4-14　cDNA文库的构建流程

为了构建cDNA文库，必须分离高质量的总RNA，并从中纯化出mRNA，逆转录成cDNA后克隆，如图4-14所示。在这过程中，用含Oligo（dt）的引物（为方便后继克降可以在引物5′端加接具有限制酶识别位点的短片段）锚定mRNA的ploy（A）尾巴，通过逆转录合成cDNA第一链。能否获得全长的cDNA对后续的研究是至关的重要，为此，可以通过加入RNase抑制剂，采用耐热的逆转录酶等措施来解决。

cDNA第二条链可以采取不同的方法：最常用的有自身引物合成法、置换合成法、引物合成法（图4-14）。以自身引物合成法为例：当cDNA—mRNA杂合体用碱处理后获得单链cDNA，随即在3′端成一个短小的发卡结构，此发卡结构可以作为引物合成第二链。最后用S1核酸酶处理除去末端发卡结构，但5′端部分序列会因此而失去。用其他两种方法可以获得近乎全长的ds cDNA。随后，双链cDNA末端补平后进行甲基化处理以防止后续酶将cDNA切割，然后加接头或衔接物，与相应的载体体外连接后，导入大肠杆菌中形成初库，最后扩增成终库保存。

3.筛选基因文库获取目的基因

基因文库构建完成就可以从中筛选目的基因了。筛选方法一般有核酸分子杂交法和免疫学筛选法。将构建好保存的基因文库材料铺平板，形成含不同外源DNA分子的重组转化子菌落或噬菌斑（图4-15）。用菌落或噬菌斑原位杂交法可以筛选出含目的基因的阳性克隆。杂交所用的核酸探针来源于已获得的部分目的基因的片段，或目的基因表达蛋白质的部分氨基酸序列反推得到的一群寡核苷酸，或其他物种的同源基因。

图4-15　文库筛选策略

（引自刘祥林：基因工程，2005）

如果构建了表达型cDNA文库，可用免学法来筛选目的基因。筛选目的基因所用的专一性抗体既可以是从生物本身钝化出目的基因表达蛋白的抗体，也可以是从目的基因部分ORF片段克隆在表达载体中获得表达蛋白的抗体。由于筛选技术、探针及抗体等方面的原因，筛选得到的克隆可能还有一部分假阳性克隆，需要进一步采用限制酶酶切、PCR和测序等方法验证。当前，随着基因工程技术的发展，构建基因文库的方法和获取目的基因的方法也在不断完善，不妨参阅新近有关《基因工程》专著。