基因工程载体：PUC和Ti质粒的应用

二、基因工程载体

通常把能携带外源基因进入受体细胞的运载工具称为基因克隆载体，即基因工程载体（vector）。基因工程是随着克隆载体系统的建立才发展起来的。常用的基因工程载体有以下几类。

1.质粒载体

（1）大肠杆菌质粒

图4-10　大肠杆菌质粒分子结构

（引自吴乃虎：基因工程原理，1999）

质粒（plasmid）是一类存在于细胞中，能独立于染色体之外进行自主复制的闭环双链DNA分子。质粒广泛存在于细菌细胞中，如霉菌、蓝藻、酵母等，在一些动植物细胞中也有质粒发现。质粒DNA分子的大小一般在1～500kb范围内，不同质粒的相对分子质量差异显著：小的质粒约为10⁶Da，仅能编码2～3种蛋白质分子，而大的质粒可达10⁸Da以上。一种质粒在一个细胞中存在的数目，称为质粒拷贝数。质粒为寄主细胞增加了某些特征，包括抗性、代谢、修饰寄主生活方式的因子。大肠杆菌的质粒载体首先得到充分研究，包括启动子、操纵位点序列、多克隆位点、转录及转译信号、质粒的载体复制起点及抗菌素抗性基因（图4-10）。

理想的质粒载体一般应具备以下特征：能独立自主复制，易从寄主细胞分离纯化，相对分子质量小，拷贝数多，易操作，而且载体DNA分子中有一个影响自身扩增的非需区，插入其中的外源基因可以像载体的正常组分一样复制和扩增。大肠杆菌质粒载体的基础研究所确立的F质粒、R质粒和Col质粒的特性为后来人工的质粒构建提供了必需条件。图4-10所编码抗生素抗性基因的质粒，即R质粒。

（2）pBR322质粒与PUC质粒载体

1977年Boliver等构建了pBR322质粒。该质粒是经人工构建的大肠杆菌质粒载体，并按照标准质粒载体命名法则命名的：p表示质粒，BR取自该质粒两位主要构建者的姓氏的头一个字母，322系指实验室编号，以与其他质粒载体如pBR325、pBR327、pBR328等相区别。pBR322质粒构建来源于三个天然质粒的部分组成。①pSF2124质粒转座子Tn3的氨苄青霉素抗性基因（amp^r）；②pSC101质粒的四环素基因（tet^r）；③Co1E1的派生质粒pMB1的DNA复制起点（ori）。多年来，pBR322质粒被广泛采用并经改进，产生了更多有用的质粒。

PUC是在pBR322质粒基础上，插入一个在其5′端带有一段多克隆位置的LacZ′基因，发展成有双功能检测特性的新型质粒载体系列。它是由美国加利福亚大学于1987年首先构建的，取名为PUC。PUC质粒载体的优点：①载体分子相应地缩小了许多，但可获得高产量的克隆DNA分子；②适用于组织化学方法检测重组体；③有多克隆位点区。

（3）PGEM系列载体

PGEM系列载体是一种与PUC十分类似的小分子的质粒载体。在其总长度为2743bp的基因组DNA中，编码有一个氨苄青霉素抗性基因和一个LacZ′基因，在后者还插入了一段含多个限制性内切酶的识别序列的多克隆位点。PGEM与PUC之间的主要差别是它具有两个来自噬菌体的启动子，即T₇启动子和T₆启动子，它们为RNA聚合酶的附着作用提供了特异性的识别位点。由于这两个启动子分别位于LacZ′基因中多克隆位点区的两侧，故若在反应试管中加入纯化的T₇或T₆DNA聚合酶，那么克隆的外源基因便会转录出相应的mDNA。

（4）Ti质粒

Ti质粒（Tumor inducimg plasmid）是土壤农杆菌（Agrobacterium tume faciens）细胞核外存在的一种环状双链DNA分子，其长度约200～250kb，相对分子质量为90×10⁶～150×10⁶。土壤农杆菌通过植物伤口侵入多种双子叶植物能形成冠瘿瘤。由于Ti质粒的这种特性，介导了细菌与植物细胞的接合，因此可作为植物基因工程中的载体。Ti质粒有3个功能区：①T-DNA区，决定肿瘤形态和冠瘿碱的合成；②Vir区感染后，与形成肿瘤有关的区；③细菌吸收和利用冠瘿碱的区域，分布着冠瘿碱分解代谢酶基因。

Ti质粒上的T-DNA，可与一定大小的外源DNA（目的基因）重组而不致影响其特性，并能与植物细胞内的染色体整合。因此，Ti质粒可作为植物基因工程的载体。现已清楚T-DNA上的tum座位密码植物激素包括生长素吲哚乙酸和细胞分裂素异戊烯腺苷合成酶。如将tum座位切除或使其部分缺失，就可使Ti质粒成为非致癌性的。农杆菌感染植物时，由于不是每个植物细胞都会接受T-DNA，为了区别转化与非转化细胞，在T-DNA中插入外源目的基因的同时，还需要插入选择标记基因。卡那霉素是真核生物比较有效的生长抑制剂，因此，抗卡那霉素基因kan^r被广泛用作选择标记基因。

Ti质粒能转化裸子植物和双子叶植物。利用基因工程已将Ti质粒转化到禾类植物玉米上，这为单子叶植物克隆载体带来希望。Ti质粒中的T-DNA能整合到宿主ch-DNA上成为正常的遗传成分，世代相传。T-DNA上的opine合成酶基因具有一个强启动子，能启动外源基因在植物细胞中高效表达，这都是Ti质粒的优点。但直接使用Ti质粒也存在两大困难：一是Ti质粒相对分子质量太大（约208kb）、限制酶位点多，不易进行体外重组DNA操作。二是被T-DNA转化的植物细胞或肿瘤细胞，不能进行分化，再生成植侏。这也是Ti质粒作为载体的缺点。于是，人们对Ti质粒进行改造，以符合载体的需求。其中，作为植物病毒载体提高植物抗病性已取得成功。将Ti质粒与病毒结合起来，利用这一载体，即所谓土壤农杆菌介导的病毒感染技术，可把植物病毒的DNA或RNA的cDNA导入植物，使转化的植物通过病毒系统感染而获得抗病性。有关植物RNA病毒载体的构建，最早在烟草花叶病（TMV）、大麦条纹花叶病毒（BSMV）和马铃薯（PVX）中实现。

2.噬菌体载体

噬菌体（phage）是一类细菌病毒的总称。噬菌体的结构要比质粒复杂，病毒颗粒主要由DNA（或RNA）和外壳蛋白组成。DNA上除了具有复制起点外，还有编码外壳蛋白质基因。通过感染，病毒颗粒进入宿主细胞，利用宿主细胞的合成系统进行DNA（或RNA）复制和蛋白质的合成，实现病毒颗粒的增殖。不同种类的噬菌体颗粒在结构上差别很大，大多数菌体呈带尾部的20面体型，如λ噬菌体，还有相当部分为线状体，如噬菌体M13。根据噬菌体与宿主的关系，可把它分为温和性噬菌体和烈性噬菌体。由于温和噬菌体不会导致宿主细胞死亡，并且溶源细胞可以传代，因此，它是构建噬菌体克隆体的好材料。

（1）噬菌体载体

λ噬菌体的结构分头部和尾部两部分，λDNA集中在头部。DNA分子呈线状，分子质量30.8×10⁶Da，全长48502bp，具有60多个基因，其基因组分为几个不连续的区域，相关基因成簇排列，形成若干操纵子。当λDNA进入宿主细胞后，黏性末端连接形成环状DNA分子，可以有两种不同方式繁殖（图4-11），即溶菌性和溶原性。由于人们对λ噬菌体的基因编码和复制过程的功能都有深入的研究，因此，选用λ噬菌体作为构建克隆材料取得了很大进展。构建λ噬菌体克隆载体的基本策略包括：在DNA上切去部分非必需的区域；抹去多余的限制性核酸内切酶切割位点；插入可供选择的标记基因和建立体外包装系统等，应用外包装的λ噬菌体，可以获得产量高、重组率高以及插入外源基因片段长度较长等优点的λ噬菌体重组体，在基因工程中发挥了重要作用。

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图4-11　λ噬菌体的溶菌和溶原繁殖方式

（2）M13噬菌体载体

大肠杆菌丝状噬菌体包括M13噬菌体和f噬菌体等，其基因组均是单链闭环DNA分子，故M13噬菌体又称为单链噬菌体。M13含总长6407个碱基核苷酸，编码若干个外壳蛋白，共有2700个蛋白分子形成一个管状结构，将DNA单链包裹在管内。M13感染大肠杆菌后，以感染性单链DNA（正链）为模板，复制另一条（负链），形成双链DNA。然后以负链为模板，滚动式复制串联式上链分子，当拷贝数达到100～200个时，因产物干扰复制而停止。取感染M13的细菌培养离心，即可得到双链DNA，供限制酶切割等分子克隆操作之用。

野生型M13的基因组基因Ⅱ和Ⅴ之间（共有10个基因），有一个508bp的非必需区，可插入外源DNA而不影响噬菌体的增殖。其余基因都含有与其复制有关的遗传信息。M13载体的mp系列就是在其基因Ⅱ和Ⅴ之间插入的外源基因，并将多克隆位置引入lacZ′基因的氨基末端等因素的构建。M13载体的优点：①从细菌中释放出来的噬菌体颗粒只含单链DNA，因此可用来作为对DNA测序的模板；亦可用来产生单链的DNA探针以选择和分离互补的DNA。②M13的双链型DNA，便于限制酶的识别和切割，克隆进双链的外源DNA。③感染细菌后，复制环状DNA经包装形成噬菌体颗粒，分泌到细胞外而不产生溶菌。这不仅便于分离单链的DNA，而且在产生大量的单链DNA中，含有外源DNA序列，可以抽提取来。

（3）柯斯质粒载体

Cosm id一词，是由英文“Cos Site Carrying plasmid”缩变而成的，其原意是带有黏性末端位点（COS）的质粒。1978年，J.Collins等人发展出柯斯质粒载体，也称黏性质粒或黏粒。这是一类人工构建的含有抗性基质、单一克隆位点以及λDNACos位点（体外包装所必需）的细菌质粒。它比λ噬菌体具有更大的克隆能力，在真核基因克隆中起到了很大的作用。

图4-12　柯斯质粒载体PHC79的结构

构建的柯斯质粒载体是一种环形双链DNA分子，大小为4～6kb。它由三部分组成：①具有抗性标记和一个质粒复制起始部位；②一个或多个限制酶的单一切割点；③一个带有λ噬菌体的黏性末端片段。

在柯斯质粒载体PHC79的结构中（图4-12），来自PBR322的部分是一个完整的复制子，编码一个复制起点和两个抗生素抗性基因Amp^r和Tet^r。来自λDNA部分的片段除了提供COS位点外，在COS的两侧还具有与噬菌体包装有关的DNA短序列，这样就能够包装成有感染性的噬菌体颗粒。很明显，PHC79柯斯质粒兼具了λ噬菌体载体和PBR322质粒载体两方面的优点，其克隆能力为31～45kb。

3.人工染色体克隆载体

在真核细胞基因功能研究以及定向克隆等工作中，常常需要克隆几百乃至几千kb的大片段DNA，而传统载体系统如质粒、λ噬菌体、COS质粒等的最大容量不超过50kb，就显得不够用了。这样的需求使人工染色体克隆载体孕育而生。人工染色体克隆载体是一种“穿梭”克降载体，即含有质粒真核载体必备的第一受体（大肠杆菌）的质粒复制起始点（Ori），同时还含有第二受体（如酵母）染色体DNA着位点、端粒和复制起始点的序列以及合适的选择标记基因。这样才能复制与传递可选择标记。

（1）酵母人工染色体克隆载体

1983年，Murray等人将酵母染色体DNA复制起点（ARS）和着丝粒（CEN）以及必需的选择标记基因序列克隆对大肠杆菌质粒PBR322中，染色体DNA的端粒则来自四膜虫（tetrahymena）巨核核糖体DNA（rDNA）分子末端分离得到的顺序。它本身不是端粒顺序，但可作为一种“端粒接种顺序”以很高的频率形成有功能的端粒。这种组装的载体就构成了酵母人工染色体（yeast artificial chromosome，YAC）克隆载体。随后YAC载体又有了改造，组装了供插入外源DNA片段的克隆位点。常用的YAC克隆载体有3种：PYAC3、PYAC4和PYAC5。

（2）细菌人工染色体克隆载体

1992年，Shizuya等人构建出细菌人工染色体（bacterial artifical chromosome，BAC），尽管BAC克隆容量350kb，较YAC小，但克服了YAC的某些缺陷，具有稳定性高、易操作的优点。BAC的复制子来源于单拷贝质粒F因子，故BAC在宿主菌内只有极少数拷贝，可稳定遗传，无缺失、重组和嵌合现象；而且以E.Coli为宿主，转化效率较高。在检测上，采用蓝白斑、抗生素、菌落原位杂交等均可用于目的基因筛选，并可对克隆在BAC的DNA直接测序。上述特点使得BAC与YAC系统相得益彰，从植物到小鼠乃至人类系统都得到广泛应用，成为目前转基因研究的热点和发展方向之一。

（3）哺乳动物人工染色体载体

YAC的成功对构建哺乳动物人工染色体（MAC）是一个极大的鼓舞。设计的MAC的最大优点是能容纳大于1000kbp的外源DNA，甚至可以提供精确有丝分裂和减数分裂所需的染色体。因此，它可用于研究哺乳动物细胞中染色体的功能及遗传疾病的治疗。

MAC的基本构件包括复制起点、端粒和着丝粒。端粒已经分离出来，但人的着丝粒和复制起始点的分离要困难得多。因为人的着丝粒非常大，也非常复杂。Y染色体着丝粒包括大量串联重复的DNA（240～1600kb），两侧还排列着一些微卫星和局部重复顺序。而哺乳动物染色体的复制起点可能不止一个，一条染色体上可能有多个复制起点，且长短不等。这些都增加了对分离和结构与功能研究的难度，所以，哺乳动物人工染色体的研究目前尚在缓慢进行之中。

4.动物病毒载体

质粒和噬菌体载体只能在细菌中繁殖，不能满足真核DNA重组需要。感染动物的病毒可改造用作动物细胞的载体。由于动物细胞的培养和操作较复杂、花费也较多，因而病毒载体构建时一般都把细菌质粒复制起始序列放置其中，使载体及其携带的外来序列能方便地在细菌中繁殖和克隆，然后再引入真核细胞。目前病毒载体常用的有改造来自猴肾病毒SV40（simian virus 40）、逆转录病毒和昆虫杆状病毒等，使用这些病毒载体的目的多为将目的基因或序列放入动物细胞中表达，或试验其功能，或作基因治疗等。