基因工程中的Ⅱ型限制酶及其应用

一、基因工程酶学

1.限制酶和DNA连接酶

（1）限制性核酸内切酶

限制性核酸内切酶简称限制酶（restriction enzyme），是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并在相关位置切割DNA双链结构的核酸内切酶。它们主要是从原核生物中分离纯化获得的，至今已从近300种不同微生物中分离出了2300种限制性核酸内切酶。在限制酶的作用下，侵入细菌的外源DNA分子被切割成大小不同的片段，使其基因失去功能，而细菌本身的DNA因受到一种甲基化酶的保护而免遭降解。限制酶的发现（1968）和应用使得DNA分子的体外切割成为可能，也使体外重组技术的应用成为可能。

目前根据酶的识别序列及切割位点、催化条件及是否具有修饰酶活性，将限制酶分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。Ⅱ型限制酶即通常所说的限制酶，具有这类酶的微生物其限制、修饰系统分别由两种不同方式完成，即限制性内切酶和修饰性甲基化酶。Ⅱ型限制酶的特点是相对分子质量小，仅需Mg^2＋作为催化反应的辅助因子，能识别并切割DNA链上的特异性核苷酸顺序，产生特异性DNA片段，因此，它在基因工程中有着广泛的应用。

多数Ⅱ类酶的识别序列为4、5或6个碱基对，并且具有180°旋转对称的回文结构，即有一个中心对轴，序列正读和反读是一样的。Ⅱ型限制酶对DNA的切割有两种方式：

①黏性末端：限制酶在识别序列时进行交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，所以称为黏性末端，如ECORI的识别顺序为：

垂线表示中心对称轴，两链读核苷酸从5′到3′顺序都是GAATTC，这就是回文顺序。在双链交错切割生成5′—G和AATTC—3′、3′—CTTAA和G—5′两个DNA片段，各有一个单链末端，二条单链是互补的，可通过DNA连接酶的作用而黏合。

②平端：Ⅱ型酶切割方式的另一种是同一位置切割双链，产生平端，例如EcoRV的识别位置是：

5′—GAT′｜ATC—3′

3′—CTA′｜TAG—5′

切割后形成5′—GAT和ATC—3′、3′—CTA和TAG—5′。这种平端同样可以通过DNA连接酶连接起来。

（2）DNA连接酶

DNA连接酶广泛存在于各种生物体内，其催化的基本反应是将DNA双链上相邻的3′—羟基和5′—磷酸基因共价结合成了3′、5′—磷酸二酯键，使原来断开的DNA缺口重新连接起来，因此，它在DNA复制、修复以及体内外重组过程中起着重要作用。

最常用的DNA连接酶是T₄DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。T₄DNA连接酶是由大肠杆菌（E·coil）T₄噬菌体DNA30编码的产物，最早从T₄噬菌体感染的大肠杆菌中分离纯化的，相对分子质量为60KD，是一种单链多肽酶能催化两个DNA片段的3′—OH末端和5′—P末端形成磷酸二酯键，需要ATP作为辅助因子并由ATP提供能量。T₄噬菌体DNA30现已被克隆，并可在大肠杆菌中大量表达，因此T₄DNA连接酶比较容易制备。此酶可高效催化dsDNA片段间黏末端的连接，并可催化平端DNA片段的连接。

大肠杆菌DNA连接酶又称为E.coliDNA连接酶，是由大肠杆菌染色体基因组中Lig基因编码的，相对分子质量为75KD。Lig基因已被克隆，并能在相应大肠杆菌细胞中大量表达。此酶不能催化平端DNA分子之间的连接，其底物只能是带缺口的dsDNA分子和具有同源互补黏末端的不同DNA分子，并以NAD^＋作为辅助因子。

图4-8　PCR反应过程

在真核生物细胞中也存在DNA连接酶，且有两种类型，分别称为连接酶Ⅰ和Ⅱ，反应中利用ATP提供能量。DNA连接酶Ⅰ分子质量约为200KD，主要存在于生长旺盛细胞中，DNA连接酶Ⅱ分子质量约85KD，主要存在于生长不活跃的细胞中。它们的催化反应在DNA复制和修复过程中都起重要作用。

2.DNA聚合酶和反转录酶

（1）DNA聚合酶

DNA聚合酶（DNApolymerase）催化以DNA为模板合成DNA反应，在分子克隆技术中主要用于DNA的体外合成、探针的标记等。经常使用的DNA聚合酶有大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ（全酶）、大肠杆菌DNA聚合酶的klenow片段（即klenow酶）、T₄DNA聚合酶、耐热DNA聚合物以及反转录酶等。这些DNA聚合酶反应的共同特点是：要以四种脱氧核糖核苷酸作底物；聚合反应需要DNA模板的指导；要有引物3′—羟基的存在；新链的合成方向为5′→3′。由此看出DNA聚合酶合成的产物是模板性质相同的复制品。(www.xing528.com)

大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ，简称DNAp01Ⅰ，又称kornberg酶，它是大肠杆菌P01 A基因编码，由一条多肽链组成，分子质量为109KD。在大肠杆菌中，每个细胞约有400个分子的DNA聚合酶Ⅰ。在37℃下，1分子DNA聚合酶1分钟可以催化约1000个核苷酸的聚合。DNA聚合酶Ⅰ是一个多功能酶，具有三种活性，即5′→3′聚合、5′→3′外切活性和3′→5′外切活性。

大肠杆菌聚合酶Ⅰ全酶经枯草杆菌蛋白酶处理，可以产生分子质量为67KD和35KD两个大小不同的片段。其中大片段由Klenow等人于1970年报道，故称为Klenow片段，也称Klenow聚合物。该酶具有两种催化活性：①5′→3′聚合酶活性，可以合成DNA；②3′→5′外切酶活性，可从3′端降解DNA，但是，它失去了5′→3′外切酶活性。此外，该酶在DNA克隆中的主要用途：通过聚合作用填补或标记DNA的3′隐蔽末端；催化合成cDNA的第二链及DNA序列测定。

大肠杆菌DNA聚合酶Ⅱ（DNApolⅡ）：DNA聚合酶Ⅰ缺陷的突变株仍能生存，这表明DNApolⅠ不是DNA复制的主要聚合酶。人们开始寻找另外的DNA聚合酶，并于1970年发现了DNApolⅡ。此酶分子质量为120KD，每个细胞内约有100个酶分子，但活性只有DNApolⅠ的5％。该酶的催化特性如下：

①聚合作用：该酶催化DNA的聚合，但是对模板有特殊的要求。该酶的最适模板是双链DNA中间有空隙（gap）的单链DNA部分，而且该单链空隙部分不长于100个核苷酸。对于较长的单链DNA模板区该酶的聚合活性很低。但是用单链结合蛋白（SSBP）可以提高其聚合速率，可达原来的50～100倍。

②该酶也具有3′→5′外切酶活性，但无5′→3′外切酶活性。

③该酶对作用底物的选择性较强，一般只能将2-脱氧核苷酸掺入到DNA链中。

④该酶不是复制的主要聚合酶，因为此酶缺陷的大肠杆菌突变株的DNA复制都正常。可能在DNA的损伤修复中该酶能起到一定的作用。

大肠杆菌DNA聚合酶Ⅲ（DNApolⅢ）：DNApolⅢ全酶由多种亚基组成，而且容易分解。大肠杆菌每个细胞中只有10～20个酶分子，因此不易获得纯品，给研究该酶的各种性质和功能带来了许多困难。直到不久前，才对其性质和功能有所了解，但每个亚基的具体作用仍不十分清楚。尽管该酶在细胞内存在的数量较少，但催化脱氧核苷酸掺入DNA链的速率分别是DNA聚合酶Ⅱ的15倍和30倍。该酶对模板的要求与DNA聚合酶Ⅱ相同，最适模板也是链DNA中间有空隙的单链DNA，单链结合蛋白可以提高该酶催化单链DNA模板的DNA聚合作用。DNApolⅢ也有3′→5′和5′→3′外切酶活性，但是3′→5′外切酶活性的最适底物是单链DNA，只产生5′—单核苷酸，不会产生二核苷酸，即每次只能从3′端开始切除一个核苷酸。5′→3′外切酶活性也要求有单链DNA为起始作用底物，但一旦开始后，便可作用于双链区。DNA聚合酶Ⅲ是细胞内DNA复制所必需的酶，缺乏该酶的温度突变株在限制温度（non permissive temperature）内是不能生长的，此种突变株的裂解液也不能合DNA，但加入DNA聚合酶Ⅲ则可以恢复其合成DNA的能力。

真核生物的DNA聚合酶：真核生物中也具有几种DNA聚合酶，但这些聚合酶都没有3′→5′或5′→3′外切酶活性。其聚合反应机制与原核生物的聚合一样。主要的酶（占总量的80％～90％）是DNA聚合酶α，分子量为300KD，含有4个或5个亚基，主要负责染色体DNA的复制。DNA聚合酶β，分子量为45KD，仅含有一条链，主要作用是修复核内DNA。第三种聚合酶γ，分子量为140KD，存在于线粒体内，负责催化线粒体DNA的复制。最近从兔的骨髓细胞质中分离到一种新的DNA聚合酶，这种酶与上述真核生物的DNA聚合酶不同，而与原核生物的聚合酶类似，具有3′→5′核酸外切酶活性，称为DNA聚合酶δ。另外，也从酵母、原虫等低真核生物中分离到一些DNA聚合酶。一般来说，这些低等生物都没有低分子量的DNA聚合酶β，而且与原核生物的DNA聚合酶相似，有3′→5′外切酶活性。

（2）Taq DNA聚合酶

Taq DNA聚合酶是第一个被发现的热稳定DNA聚合酶，分子质量为65KD，1986年由Erlish等从温泉中分离的一株水生噬热杆菌（Thermus aquaticus）中提取获得。此酶具有5′→3′聚合活性和5′→3′外切活性，且能耐高温，在70℃反应2h后其残留活性还能保持原来的90％以上。1998年Saiki等将Taq DNA聚合酶成功地用于PCR技术，对DNA的特定序列进行体外扩增。在PCR循环过程中，Taq DNA聚合酶在变性步骤中（约94℃）不易失活，可直接进入下一轮循环，因此不必每轮循环时重加入新酶。这使得Taq DNA聚合酶成为PCR技术中的独特用酶（图4-8）。

（3）反转录酶

反转录酶（reverse transcriptase），又称为依赖RNA的DNA聚合酶。1970年Tem in等人在致癌RNA病毒中发现的一种特殊的DNA聚合酶，它以RNA为模板，dNTP为底物，tRNA为引物（主要是色氨酸tRNA），在tRND3′—OH末端上，根据碱基配对原则，按5′→3′方向，合成一条与RNA模板互补的单链，这条DNA单链叫互补DNA即cDNA。随后，在反转录酶的作用下，水解掉RNA链，再以cDNA为模板合成第二条DNA链，如图4-9所示。这一过程与一般遗传信息流转录（由DNA→RNA）的方向相反，因此，由RNA→DNA的过程称之为反转录作用。现已发现反转录酶不仅普遍存在于病毒之中，而且哺乳动物的胚胎细胞和正在分裂的淋巴细胞中也有反转录酶。

图4-9　反转酶催化DNA分子合成

基因工程中有两种商品化的反转录酶：一种来自纯化的禽成髓细胞瘤病毒（avian myoblastosis virus，AMV）提取的；另一种是Moloney鼠白血病病毒（moloney murine leukemia virus，Mo-MIV）克隆的反转录酶编码基因在大肠杆菌的表达产物。这两种反转录酶的主要区别：禽源反转录酶在42℃（鸡的正常体温）能有效地发挥作用，而鼠源的则迅速失活。携带反转录酶的病毒又称反转录病毒，它侵入宿主细胞后，先以病毒RNA为模板依靠反转录酶催化合成DNA，随后这种DNA环化并整合到宿主细胞的染色体DNA中去，以原病毒的形式在宿主细胞中一代代传递下去。近来发现许多反转录病毒基因组中都含有癌基因（oncogene），如果由于某种因素激活了癌基因就可使宿主细胞转化为癌细胞。

3.修饰酶类

在基因克隆技术中，除了限制酶、连接酶、聚合酶等主要工具酶外，还经常使用某些酶的相关功能对DNA和RNA分子进行修饰，故有修饰酶类之统称。例如，以末端转移酶的功能为基础建立了同聚物着尾法连接DNA片段，使用碱性磷酸酶切除DNA片段5′—端磷酸基以有效地防止载体DNA的自身环化等。

（1）S₁核酸酶是由米霉霉（Aspergillusoryzae）中提取的，它是一种特异性单链核苷酸外切酶，能降解DNA和单链RNA，产生5′单链核苷酸或寡核苷酸。S₁核酸酶是在基因工程中用途很多，如消化限制酶产生的黏末端，使之成为平端，降解cDNA合成过程中形成的发卡环结构；在RNA—DNA杂交后，结合S₁核酸酶水解，可确定内含子的位置。

（2）碱性磷酸酶（alralime phosphatase）有两种：一种是从大肠杆菌中分离的，叫细菌碱性磷酸酶（BAP），另一种是从小牛肠中分离的，叫小牛肠碱性磷酸酶（CAP）。其共同特点是，特异性切去DNA或RNA分子的5′—P，从而使DNA或RNA分子5′—P末端转换为5′—OH末端，即所谓核酸分子脱磷酸作用。碱性磷酸酶在基因工程中的应用主要在于制备5′—末端标记的核酸探针和防止DNA重组中载体的自身环化。

（3）T₄多聚核苷酸激酶（T₄poly nucleotide kinase）简称T₄激酶，来源于T₄噬菌体感染的大肠杆菌细胞，并且已在多种哺乳动物中发现。T₄激酶可催化γ位上磷酸从ATP分子转移给DNA或RNA的5′—OH末端。这种作用不受底物分子链的长短限制，甚至单核苷酸也同样适用。该酶广泛应用于DNA和RNA的末端标记，标记时以［γ-³²p］ATP作为底物。

（4）末端脱氧核苷酸转移酶，简称末端转移酶（termind transferase），是从小牛胸腺中纯化出的一种相对分子质量较小（34×10³）的碱性蛋白酶。末端转移酶催化5′—脱氧核苷三磷酸转移到另一个DNA分子的3′—OH末端，即进行5′→3′方向聚合作用。与DNA聚合酶不同，它不需要模板存在，就可以催化DNA分子聚合。在基因工程中，利用末端转移酶不需要模板，但4种dNTP中任何一种都可作为反应前体物的特性，可以给平端DNA片段3′—OH加上同聚物PolyC或PolyG或PolyT、PolyA，形成同聚物尾巴，造成人工黏末端，有利于DNA重组。