植物无病毒材料的保存技巧

一、植物无病毒材料的保存

脱毒获得的植物材料，经反复鉴定确系无病毒材料，可作为无病毒原种材料进行扩繁。但植物无病毒材料并不是具有额外的抗病特异性，如果它们的后续培养不当仍有可能被重新感染病毒，成为带毒材料。所以通常将脱毒获得的植物无病毒原种材料，进行隔离保存和繁育。

（一）隔离栽培保存

通常，较大的无病毒苗可直接种植在300目以上网纱的防虫温室内，以防止蚜虫、叶蝉等病虫传媒的进入。栽培用的土壤也应进行消毒，周围的生长环境也要整洁、通风、透光，栽植期间及时做好农、肥、水管理工作，并适时喷施农药预防病虫害的发生，以保证无毒苗在与病毒充分隔离的条件下生长繁殖。

（二）离体保存

较小的无病毒材料，可利用植物组织培养技术进行材料的保存或扩繁，这就是通常讲的离体保存技术。离体保存方法，按保存的温度不同，可分为常温保存、低温保存和超低温保存，其中，低温保存和超低温保存为常用。

1．低温保存（缓慢生长保存）

将无病毒原种材料的器官或幼小植株接种到培养基上，通过降低培养温度等环境条件，使培养物在低温条件下生长降低到最低限度，又不至于死亡，达到长期保持的目的，这种保存方式被称为低温保存，又叫缓慢生长保存法、最小生长法。该方法只需半年或一年更换一次培养基，是中长期保存无病毒材料及其他优良种质的一种简单、有效且安全的手段。

不同植物物种、品种对培养温度的反应差异较大，低温保存无病毒材料时，要根据各自物种品种的生物学特性设置不同的保存温度。一般情况下，温带植物多在0～4℃温度条件保存较好，热带植物多在15～20℃温度条件保存较好。

2．超低温保存（冷冻保存）

超低温保存的理论依据是：在超低温条件下，植物保存材料组织细胞结冰速度很快，没来得及形成冰晶而迅速转化成玻璃化状态，有效避免了细胞内结冰所导致植物组织细胞的死亡。超低温保存是通常利用液态氮LN（－196℃）离体保存植物种质材料，是长期保存植物无病毒材料及优良种质的一种有效手段。植物材料进行超低温保存时，一般要经过材料的选择、材料的预培养、冷冻保护、冷冻、保存、解冻、再培养等七个阶段。

（1）材料选择

用于超低温保存的植物脱毒材料的细胞形态、生理状况极显著影响着超低温离体保存的成败。一般情况下，保存时宜选择无病毒、细胞小、胞质浓、无液泡、抗冻性强的分生组织细胞材料，如茎尖生长点、组培过程中新产生的不定芽生长点、愈伤组织等具有旺盛分生能力的分生性组织细胞。胞质相对较稀、高度液泡化的细胞超低温时容易产生胞内冰晶而损伤细胞组织结构，导致死亡。

另外，超低温保存前要能大致确定冷冻材料的体积，一般冷冻材料的体积宜控制在0.2～10ml范围内。如果材料体积过大，不利于均匀冷冻和后期的解冻处理；体积过小，又难保证再培养时材料有足够的再生活力。

（2）材料预培养

在预培养的培养基中加入脯氨酸、甘露醇、山梨醇等渗透剂，可减少材料细胞内自由水的含量，提高保存材料的抗冻性。(www.xing528.com)

（3）冷冻保护

材料冷冻前添加冷冻保护剂处理，有助于材料在冰冻前期细胞进行保护性脱水，降低冰点和水的饱和点，进一步阻止冰晶的形成，减少冷冻伤害。常用冷冻保护剂有二甲亚砜DMSO（5～8%）、甘油、脯氨酸（10%）、聚乙二醇6000（10%）、各种可溶性糖等，其中二甲亚砜DMSO最常用。

方法：取出预培养材料适当干燥处理，转入盛有液体培养基的无菌培养皿，然后在0℃条件下逐渐加入冷冻保护剂（30～60min内添加冷冻保护剂量至原有材料组织体积的3倍左右），使保护剂逐步渗透到材料中。

（4）冷冻

加冷冻液，加好后保持10min，吸去冷冻液，将材料转入事先装有1ml左右冷冻液的无菌小冻存瓶中。然后选择不同的冷冻方法进行冷冻。

①快速冷冻法。将0℃或是预处理过的材料直接投入液氮中，使材料所含的水分还没来得及形成冰晶就已迅速转化成玻璃化状态。此法只对部分植物有效，常适用于高度脱水的无病毒材料。

②慢速冷冻法。需要借助程序降温器，使保存材料以0.1～4℃·min^－1降温速度降到－100℃后再转入液氮。此法常适用于悬浮培养的植物细胞和愈伤组织。

③逐级冷冻法。先以每分钟下降5～6℃·min^－1的降温速度，使材料冷却到－50～－30℃，在此温度下预冻一段时间（通常为30min左右）后，再转入液氮中迅速降温。此法常适用于植物茎尖材料的离体保存。

（5）保存

在离体保存过程中，应注意液氮量的变化，不断地及时补充液氮，避免保存温度上升到－130℃以上，才能确保保存材料能长期离体保存。

（6）解冻

通常的解冻方法是将保存材料从－196℃的液氮中取出后，投入37～40℃温水中，轻轻振动使之快速解冻（解冻速度达500～750℃·min^－1时，解冻较为理想），使材料迅速通过冰晶温度生长区（－60～－40℃），避免温度缓慢上升过程中材料组织细胞内结冰而受伤害。

另外，值得注意的是，如果离体保存材料的冷冻管是特殊塑料制成的，解冻所用的温水温度可稍高些，可达60℃左右；如果离体保存材料的冷冻管是玻璃管，解冻的水温则应相对低些。

（7）再培养

解冻的离体保存材料体内残留的部分冷冻保护剂，对细胞的恢复生长有一定毒害作用，所以在材料再培养前有必要清洗去除。常用再培养液体配方逐步添加到解冻的冷冻液中冲洗材料，使材料中的冷冻保护剂浓度明显下降，最后将材料转入新鲜的固体培养基中进行诱导再培养，使材料逐渐恢复生长。