直接观测法：指示植物鉴定检测植物病毒方法简介

一、直接观测法

直接观测法即直接观察待测植株生长状态是否异常，茎叶上有无特定病毒引起的可见症状，从而可判断病毒是否存在。

（一）指示植物鉴定法

多数植物病毒有其一定的寄主范围，将一些对病毒反应敏感，感病症状明显的寄主植物作为指示植物（鉴别寄主），通过接种鉴别寄主来检验待测植物体内特定植物病毒存在与否，这种病毒鉴定方法被称为指示植物鉴定法，其常用的接种方法有汁液摩擦接种和嫁接传染两种。由于植物病毒的寄主范围不同，所以实践中宜根据不同的待测病毒选择适合的指示植物，与此同时，通常还要求所选择的指示植物不但一年四季都容易栽植，并且能在较长的时期内保持对病毒的专一敏感性和可接种性。

指示植物鉴定法按选用的鉴别寄主是草本植物还是木本植物可分为草本指示植物鉴定法和木本指示植物鉴定法。

（二）草本指示植物鉴定

草本指示植物种类较多，常用的有茄科（如心叶烟、克利夫兰烟等）、豆科（如菜豆等）、藜科（如昆诺藜、苋色藜等）、苋科（如千日红等）、葫芦科（如黄瓜等）类植物等。

1．汁液摩擦接种法

汁液摩擦接种法是草本指示植物鉴定中较常用的一种检测手段。其基本操作程序简单介绍如下：

温馨提示

汁液摩擦接种鉴定中常用的接种提取缓冲液为0．02～0．1mol·L^－1、pH为7．2～7．8的磷酸缓冲液。

当待测样品为木本植物时，提取缓冲液应在用前加入一定浓度的抗氧化剂（常见的有0．02mol·L^－1巯基乙醇、2．5%烟碱等），以降低多酚及单宁类物质氧化对病毒的钝化作用。

接种时，从被鉴定植物上取一定量的组织材料，如叶片、花瓣、根或枝皮等（实践中多取用叶片），置于研钵中，加入2～5倍的提取缓冲液，在低温条件下研磨，磨碎后用纱布滤去渣滓，在汁液中加入少量500～600目的金刚砂作为指示植物叶片的摩擦剂，再用干净的纱布或棉球、刷子等蘸取汁液在指示植物叶面上轻轻涂抹，摩擦2～3次进行接种，接种完毕后用清水冲洗指示植物叶面。为确保接种质量，接种宜在有防虫网隔离的温室中进行，接种后的指示植物宜放置在保温20～28℃温度条件、半遮阴的环境下培养管理及观察。通常在接种后的数天或几周，我们可以根据指示植物的症状表现作出初步判断。

2．小叶嫁接接种法

一些草本植物病毒，其采用汁液摩擦接种法进行指示鉴定比较困难时，常采用小叶嫁接法进行接种鉴定，如草莓病毒鉴定常用小叶嫁接接种法（见图6-3）。该法以去植株顶部小叶的指示植物作砧木，被鉴定植物小叶作接穗，采用劈接法嫁接培养指示植物，观察判断待测植株是否带毒。

图6-3　草莓病毒指示植物小叶嫁接鉴定（熊庆娥，2000）

（三）木本指示植物鉴定(www.xing528.com)

多年生果树和林木植物病毒一般均可通过自然寄主嫁接进行传染，当自然寄主侵染植物病毒后不能表现出显著的病状特征时，我们可另选择对该病毒较敏感的木本指示植物进行嫁接鉴定。目前，生产研究中常用的果树指示植物种类较多，现以柑橘、苹果、梨、葡萄及核果类果树为例，简单介绍其主要常用指示植物和对应的病原种类（包括病毒、类病毒、细菌等病原体），具体如表6-1所示。

表6-1　果树植物病毒鉴定常用主要木本指示植物（王国平等，2005）

续表

木本指示植物鉴定一般采用嫁接法进行检验。常用的嫁接方式主要有以下几种：

1．指示植物直接嫁接法

该法要求先培育木本指示植物，然后直接在指示植物基部嫁接待检植株的芽片。

2．双重芽接法

通常病毒不能通过种子进行传染，多年生木本植物可用其实生苗作嫁接砧木。先在实生苗基部嫁接1～2个待测植株的芽片，再在嫁接上方1～2cm处嫁接指示植物的芽片，嫁接成活后对指示植物进行观察辨毒，这种嫁接法就是双重芽接法（见图6-4左）。该法一般在8月中下旬进行，次年春天苗木发芽前除去砧木萌蘗，苗木发芽后给待测植株芽枝摘心，促进指示植物接芽生长，至5月，可定期观察指示植物的病状反应。

图6-4　左图为双重芽接法鉴定，右图为双重切接法鉴定（王国平，2005）

3．双重切接法

双重切接法多在春季进行，一般的操作方法是：剪取带2个芽的指示植物及待测植株接穗，同时劈接在实生砧木上，且指示植物接穗嫁接在待测植株接穗上部（见图6-4右），接后再在植株外部套塑料袋保湿保温，有利于接口愈合成活。