茎尖微芽嫁接脱毒技术：成活组培苗安全繁殖方法

三、茎尖微芽嫁接脱毒方法

茎尖微芽嫁接技术（Shoot-tipmicrografting），指在无菌条件下，借助体视显微镜切取待脱毒植物茎尖（通常带1～3个叶原基），嫁接到无菌培养的实生砧木苗上，愈合产生脱毒完整小植株的一种植物脱毒技术。这是植物组织培养技术与嫁接技术相结合的一种脱毒技术，多用在茎尖培养生根难的木本植物中。20世纪70年代中期提出并试验应用，目前该技术在柑橘、桃、苹果等多种木本植物中获得成功应用。

（一）茎尖微芽嫁接脱毒技术依据

病毒在感病植株体内分布不均匀，越靠近植物顶端分生区域病毒浓度越低，离顶端越远的区域病毒浓度越高，植株顶端点约0.1～1.0mm范围生长区域组织几乎不含或极少含病毒；另外，种子一般不带病毒，由此形成的实生苗也不带病毒。切取待脱毒植物茎尖离体培养可获得无毒材料，但多年生木本植物中有不少植物茎尖培养材料生根诱导十分困难，难以获得完整的再生小植株，而茎尖微芽（显微）嫁接技术可以克服其茎尖培养难获完整脱毒植物的不足。

（二）茎尖微芽嫁接基本操作程序（以柑橘为例）

1．无菌砧木培养

植物病毒不易通过种子传播感染，由种子生长而来的实生苗自身不带毒，茎尖微芽嫁接在能获取脱毒植物材料的同时，可有效避开部分植物茎尖脱毒材料难生根的生产实际问题。

柑橘微芽嫁接前需要准备柑橘无菌实生砧木苗，通常情况下，我们多选择枳壳或枳橙用作柑橘的嫁接实生砧木。从鲜果中取得的鲜种子（因种皮外往往带有较多果胶物质，用解剖刀去种皮时易滑落）用清水洗净后先在室内晾1～2天，然后在超净工作台上去外种皮，而后用5%～10%的次氯酸钠溶液浸泡处理10～15min或用0.05%～0.1%的升汞溶液浸泡处理5～8min，再用无菌水冲洗3～5次（若用升汞溶液浸泡处理的，宜增加无菌水冲洗次数），最后去内种皮将种胚接种在MS或MT固体培养基中，每瓶3～4颗，于26～27℃温度条件进行暗培养，2周左右种子可萌发成茎粗1.5～2mm的无菌实生苗。

2．接穗准备与茎尖嫁接

柑橘嫩梢抽发期，采2～3cm长的嫩梢，用湿纱布或保鲜袋包裹带回试验室，去梢上较大的叶片，流水冲洗30min左右，用5%～8%的次氯酸钠溶液浸泡5～10min，无菌水冲洗3～5次，置于超净工作台上备用。与此同时，取出事先已暗培养2周左右的柑橘无菌实生砧木苗，去子叶和上胚轴顶端，并将砧木苗根系控制在5cm以内，然后在茎上端离顶部约2mm处横切一刀，深达形成层，再从茎顶部往下竖切一刀或两刀，挑去切下部分，形成“L”形或倒“T”形。而后再借助连续变倍体视显微镜切取含2～3个叶原基的柑橘茎尖，小心置于“L”形或倒“T”形砧木苗切口，使之尽可能多地与切面形成层部分接触，有条件的，可在嫁接口外再包裹微芽嫁接专用嫁接膜，具体操作如图6-2所示。

图6-2　植物茎尖微芽嫁接脱毒

3．嫁接苗培养

嫁接好的柑橘组培苗宜快速转入含较低激素浓度的MS或MT固体培养基中，每瓶1～2株，置于26～27℃温度、1500～4000lx光强、12～14h·d^－1光照条件下培养。嫁接后超过10天仍存活无污染的嫁接苗，可重点观察，此后嫁接苗砧木会不断地产生新的萌蘗，需要不断地去除之，以免影响嫁接口芽的愈合生长及芽萌发。正常情况下，嫁接苗在组培室内培养5～8周，才可长成带5～6片小叶的完整的小植株。茎尖微芽嫁接成活的组培苗，仍需抽样检毒，检测无毒后，可扩繁增殖。

（三）影响茎尖微芽嫁接脱毒成活的主要因子(www.xing528.com)

1．采穗外植体生理状态与接穗消毒处理程度

（1）外植体生理状态

刚处于萌芽状态的外植体，剥离接种后越易成活，反之，剥离处于休眠状态芽的茎尖接种，反应速度较慢，时间长了就会褐化死亡。

（2）接穗消毒处理程度

接穗外植体表面消毒程度直接关系到接种成活，过轻则易导致嫁接植株污染而影响成活，过重则易使嫁接茎尖褐化死亡，直接导致嫁接失败。通常需要根据不同的植物种类进行多次外植体消毒处理比较试验，才能筛选出较理想的接穗消毒处理方案。常用的消毒处理剂有70%～75%的酒精、2%～8%次氯酸钠或5%～7%的漂白粉溶液。处理时间可参照外植体取样与消毒内容。

2．茎尖大小与脱毒效果

参照茎尖脱毒中茎尖大小对脱毒效果的影响。

3．茎尖剥离状况

参照茎尖脱毒中茎尖剥离对脱毒成活的影响。

4．砧木种子质量及无菌砧木苗苗龄、茎粗

砧木种子宜从健康无病虫的果实中选择饱满的正常种子。砧木种子离体暗培养萌发苗茎粗达2mm左右即可用作茎尖微芽嫁接砧木苗。如柑橘中枳壳或枳橙种子在26～27℃温度条件下暗培养14d左右时，茎粗达1.5～2mm左右，可用于茎尖微芽嫁接。

5．微芽嫁接方式

目前微芽嫁接方式有“L”形、倒“T”形、“△”形、“⊥”压法、“⊥”形改良法等多种嫁接方式，其中“L”形、倒“T”形、“△”形嫁接法较常用。选择合适的嫁接方式，使嫁接口茎尖与砧木切面形成层部分紧密接触，有助于提高微芽嫁接成活率。

6．培养基及培养条件

参照茎尖脱毒中培养基及培养条件。