茎尖离体培养脱毒方法及操作流程

二、茎尖培养脱毒方法

（一）茎尖培养脱毒的原理

1．病毒在植物体内的分布

病毒在感病植株体内分布并不均匀，病毒的数量随植株部位及年龄而异，越靠近植物顶端分生区域病毒浓度越低，离顶端越远的区域病毒浓度越高，植株顶端约0.1～0.5mm范围生长区域组织几乎不含或含病毒极少。利用植物的茎尖或根尖离体培养，可有效获取无病毒再生材料。

2．茎尖脱毒的理论依据

通常植物分生区域组织细胞尚未形成维管束，病毒只能通过胞间连丝传递，赶不上细胞不断分裂和活跃的生长速度，因此在分生组织中病毒移动及复制受阻。与此同时，分裂活跃的分生组织中内源生长素含量高，也在一定程度上抑制了病毒的扩繁。因此，植物顶端分生组织无病毒或病毒浓度极低，几乎检测不出。

（二）茎尖脱毒培养基本操作流程

1．外植体取样与消毒

进行茎尖组织培养时，第一步是要获取表面不带菌的接种外植体。一般情况下，先盆栽准备几株采样母本植株。采样前1～2周，对选定的目标植株喷洒1～2次多菌灵等植物杀菌剂。选在晴天剪取预处理目标植株的顶芽梢段3～5cm带回实验室，去梢上大叶片，自来水流水冲洗20～50min，留2～3cm长枝梢转入已灭菌好的锥形瓶中用70%～75%药用酒精处理10～30s，无菌水冲洗2～3次，再用2%～8%次氯酸钠或5%～7%的漂白粉溶液消毒处理10～15min，无菌水冲洗3～4次。较嫩的或茎尖包被较紧实的外植体，消毒处理可相对轻些，较老熟的或茎尖包被较松散的外植体，表面消毒处理浓度及时间相对浓些和长些。这些消毒方法，还需在工作中灵活运用，对不易消毒干净的外植体，可再增加一种合适浓度的其他种类的消毒剂如0.05%～0.1%升汞或0.1%～2%新洁尔灭等进行表面消毒，消毒效果会更好。

2．茎尖剥离与接种培养

消毒处理完毕后，将外植体放置于灭过菌的培养皿或牛皮纸上，借助连续变倍体视显微镜，在超净工作台上用解剖刀快速切取含2～3个叶原基的茎尖分生材料接种于分化诱导培养基，如图6-1所示。由于在低温和短日照下，茎尖有可能进入休眠，所以接种后材料通常置于25＋2℃温度条件、1500～4000lx光照度、12～16h·d^－1光照条件下培养，以保证茎尖外植体在较理想的人为控制环境中快速生长。茎尖离体诱导培养往往需要数月才能成功，其间要求不断地更换新鲜培养基，不断地根据外植体生长情况调整培养基激素种类及浓度等配方成分。一般情况下，茎尖培养可通过两种诱导分化途径获取再生小植株：一种是外植体直接诱导分化出芽和根，成为完整的再生植株；另一种途径是外植体先分化产生愈伤组织，再通过培养基的调整诱导分化产生芽和根。相对而言后者比前者所需的时间更长些，而且技术难度也更高些。另外，值得注意的是，部分植物的茎尖外植体可诱导出植株芽体，但生根诱导却十分困难，此时，可考虑结合试管嫁接技术获取完整小植株。

图6-1　植物茎尖培养脱毒过程

（三）影响茎尖脱毒成活效果的关键因子

1．内在影响因子(www.xing528.com)

（1）植物种类

不同的植物或者相同植物不同品种的茎尖，因其内在的遗传背景不同，在相同的培养条件下，其茎尖的生长分化情况不尽相同，需要针对不同的植物茎尖，试验选择各自适宜的培养条件。

（2）外植体的生理状态

外植体的选择直接决定着茎尖自身的营养状况及生理状态。外植体取样时，宜在萌动初期或生长较活跃的枝梢上采集饱满健壮、内在营养状况好的芽，有利于外植体茎尖接种后脱毒成活。

2．外源主要影响因子

（1）茎尖大小

茎尖取材大小与脱毒成活效果密切相关。一般情况下，茎尖取材大，茎尖离体培养时外植体容易成活，带叶原基的茎尖离体培养生长快且成苗率高。但茎尖过大，外植体虽易于成活，却不易脱除病毒。与此同时，在切取茎尖时也不是越小越好，太小不利于成活。不同植物材料脱毒适宜的茎尖大小不同，但茎尖剥取时的原则是一致的：茎尖外植体宜小到足以脱除病毒，大到足以生长发育形成完整的再生小植株。

（2）茎尖剥离状况

表面消毒好的外植体在无菌操作台上借助连续变倍显微镜剥离茎尖时的速度快慢及机械损伤程度直接关系到接种后培养是否成活。切割时生长点受伤程度过大或切取时间过长，均容易造成外植体离体培养时茎尖褐化死亡。

（3）培养基及培养条件

基本培养基：茎尖培养最常用的培养基是MS培养基，MS培养基适于多种植物的茎尖培养。除MS培养基外，White、B5、MT等基本培养基也较常用。

激素条件：适当添加一定浓度的细胞分裂素及生长素。通常，细胞分裂素／生长素浓度比例≥10时，有利于外植体朝着长芽的生理方向生长发育；不添加植物生长调节剂或仅添加生长素类植物激素，有利于外植体朝着生根的生理方向生长发育。

碳源：蔗糖或葡萄糖，以蔗糖多用，添加浓度大多在2%～4%之间。

常用培养条件：茎尖培养多采用半固体或固体培养基，在25＋2℃、1500～4000lx光照强度、12～16h·d^－1光照条件下的无菌室内培养。