组培苗生长受阻的褐化问题及解决方法

二、组培苗的褐化问题

（一）褐变的概念

褐变又称为褐化，是指培养材料向培养基释放褐色物质，致使培养基逐渐变褐，培养材料也随之变褐甚至死亡的现象。其机理是由于植物组织中的多酚氧化酶被激活，而使细胞内的酚类化合物聚合成暗黑色的大分子物质。培养材料褐化所产生的醌类物质当扩散到培养基后，会抑制其他酶的活性，导致代谢紊乱，从而影响离体材料的培养。

引起褐变的条件是：O₂、酶、底物，缺一不可。引起褐变的酶主要有：多酚氧化酶（PPO是主要的）、过氧化物酶（POD）、苯丙氨酸解氨酶等。引起褐变的酶的底物，主要是酚类化合物，可分成三类：第一类是苯基羧酸，包括邻羟基苯酚、儿茶酚、没食子酸、莽草酸等；第二类是苯丙烷衍生物，包括肉桂酸、香豆酸、咖啡酸、单宁、木质素等；第三类是黄烷衍生物，包括花青素、黄酮、芸香苷等。

（二）影响外植体褐变的因素

1．植物的种类及基因型

不同的植物、同种的不同类型、同种不同品种的植物发生褐变的程度，都具有很大的差别，这主要取决于植物体中含有的酚类物质多少以及酚氧化酶活性的强弱。就植物而言，木本植物中含有较多的酚类物质在培养过程中易发生褐变，如核桃富含单宁，极易褐变，果树植物的银杏、猕猴桃、苹果、梨、桃、板栗、无花果、葡萄、柿、香蕉、油橄榄、龙眼等多种热带果树褐变都很严重。豆科植物和芸薹属植物原生质体，培养中容易褐化也是一个普遍的问题。兰科植物在组培快繁过程中也极易发生褐变，较难成功。有研究表明，褐变的发生与酚氧化酶活性的强弱关系不明显，而与繁殖材料的总酚含量关系很大，说明褐变是一个极其复杂的过程。

2．外植体类型及生理状态

外植体的类型及其生理状态是褐变又一重要影响因素。从同种植物不同部位采集的外植体，其褐变的程度是不同的，这与植物体不同部位总酚含量和PPO的活性有关；同一外植体，不同的生理时期，其褐变的可能性及程度不同。翅果油树用幼嫩的茎段诱导愈伤组织的褐变率比老茎段的低。在对苹果不同品种进行茎尖培养时，发现冬春季取材褐变率低于其他季节。对金花梨和苍溪梨的茎尖和茎段组培褐变的周年变化规律的研究中，发现一年中金花梨外植体的POD和PPO活性最高期在4月，最低期在1月和12月；苍溪梨外植体两种氧化酶最高活性均在4月，最低活性出现时间与金花梨相似。一般而言，分化部位比分生部位接种后产生的酚类物质多，褐变严重。

3．外植体的大小及消毒时间

外植体的褐变程度受到外植体大小、消毒时间的影响。据报道，一些木本植物茎尖小于0.5mm时褐变严重，而当茎尖长度在10～15mm时褐变较轻。在卡德兰新茎的培养中也有类似的结果，新茎越大成活率越高。各种化学消毒剂对外植体的伤害也可能造成褐变，酒精对外植体的伤害大于升汞。

4．光照及温度

一般情况，暗培养有利于减轻褐变，因为在酚类化合物合成和氧化过程中，需要许多酶的参与，而其中一部分酶系统的活性受到光的诱导。桉树在全黑暗的状态下培养，效果较好。特洛皮（一种澳洲落叶灌木）在遮阴情况下培养，褐变较轻。暗培养对黑松成熟胚诱导愈伤有促进作用。

低温不仅可以抑制褐变，同时会降低PPO的活性，从而减轻褐变。桑树茎段在黑暗低温的条件下褐变较轻，辣椒的花药在低温预处理之后易产生愈伤。温度对油菜外植体褐变影响显著，当培养温度高于30℃时，外植体的褐化程度非常严重，而当培养温度为25℃～26℃时，褐化率大大降低。

5．培养基成分及类型

液体培养基可以有效地控制褐变，因为在液体培养基中，外植体产生的酚类物质可以较快地扩散，因此对外植体的伤害较轻。如在金钱松的继代培养中采用液体培养基可有效防止褐变。不同的基本培养基抑褐效果不同，如果基本培养基的无机盐浓度高，酚类物质就会大量外溢，导致外植体的褐变。如油茶在降低无机盐浓度的培养基上褐变率较低，华盖木的外植体在1／2MS的培养基上褐变率最低。

植物调节剂也是影响因素，据报道细胞分裂素会促使褐变的发生，培养基中BA的浓度在3～5mg·L^－1时，促进了沾化冬枣外植体褐变。荔枝培养基添加1mg·L^－16-BA＋0.5mg·L^－12，4-D时，愈伤组织较硬、增殖缓慢、易褐变；培养基添加1mg·L^－16-BA＋1mg·L^－12，4-D时，愈伤组织浅黄疏松、增殖快。而提高生长素浓度（如将2，4-D提高到1.0～2.5mg·L^－1），能有效促进细胞生长并缓解褐变。

培养基的pH值可能对酚类物质和酚氧化酶结合部位产生影响。在卡特兰中发现，培养基pH值为4.0～5.0时外植体的褐化多，pH值为5.5时则少。水稻的培养过程中，pH值对褐变的影响很大。较低的pH值可以减轻红豆杉的褐变。大白菜pH值为6.5时，可抑制褐变。水稻pH值为4.5～5.0时，生长状态良好，其表面呈黄白色；pH值为5.5～6.0时，愈伤组织严重褐变。(www.xing528.com)

6．抗氧化剂和吸附剂

防止酚氧化的抗氧化剂有抗坏血酸（Vc）、半胱氨酸，此外还有芸香苷、酪氨酸、柠檬酸、巯基乙醇、卵清蛋白等。吸收酚类物质的吸收剂有聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和活性炭（AC）等。有许多报道在培养基中加入抗氧化剂可以明显减少褐变发生，Vc在PPO的作用下能将醌还原成酚。当将培养基中亚硫酸钠（Na₂S₂O₃）由0.5g·L^－1提到5.0g·L^－1时褐变率由为73.8%降为8.9%；PVP、AC（活性炭）等吸收剂也可以减轻褐变的发生，在柿的组培中PVP效果最好。L-半胱氨酸、Na₂S₂O₃、Vc的作用在苹果上最强，其中L-半胱氨酸作用最为明显。在银杏的愈伤组织培养中发现植酸的效果最好，在柿的组织培养中Vc、Na₂S₂O₃较好。对一些植物同时使用多种抗氧化剂和吸附剂可能达到较理想的效果，需要筛选。

7．培养方式

外植体在培养基中的放置方式也会成为褐化的因素。如薯蓣在用茎段做外植体进行组培时，将茎段正向插入培养基中出现明显褐化，而将茎段倒插入则褐化完全消失，其原因尚不清。转瓶周期也是引起褐化的因素之一，接种初期勤转种是削弱褐化的有效办法；植入密度增大，褐化逐渐加重。

（三）防止褐变的措施

酶促褐化可以通过三种方法加以抑制：一是除去引起氧化的物质；二是捕捉或减少聚合反应的中间物；三是抑制有关的酶。通常采取以下措施防止褐化。

1．取材合适

在适当的时间，选择幼年植株取材；在植株的一定部位取材，使材料中的酚类物质含量较低等措施可减少褐化。如非洲菊的花蕾褐变较其他外植体轻，黑松可采用成熟的胚作为外植体，其褐变率较低。有些植物适宜在幼嫩期进行，有些植物需要采用半木质化的外植体，还有的需要休眠的芽。这需要在进行培养之前对培养对象进行预备试验。

2．母株和外植体的预处理

对植物母株进行遮光处理，可减少材料中酚类物质的含量。将核桃、巨桉、苹果外植体在5℃下进行低温预处理一段时间有助于减轻褐化。红豆杉采用45℃预处理对克服褐化有效，但组织的活力有较大损伤，从而影响愈伤组织的发生。为了使细胞的伤害降到最低，用于切割的解剖刀应尽可能尖锐，不过度灭菌解剖刀可减少褐化。切割外植体时在抗氧化剂或吸附剂中进行，或用这些药剂保存切下来的组织也可达到目的。预培养有助于避免酚类物质的毒害作用。在20年生的柠檬母本植株上采集茎芽，需先在液体培养基上培养3d，然后在半固体培养基上培养。如核桃外植体预先在只含有蔗糖的培养基中培养5～7d，板栗最初2～3d用一定浓度的咖啡碱或含有石灰的培养基使形成层的伤口的单宁沉淀有助于减轻褐化。

3．选择适宜的培养基和培养条件

筛选合适的培养基，在无机离子的浓度和种类上选择合适的培养基，油棕用改良的MS培养基，苹果用1／2MS的培养基可减轻褐化。在激素的浓度和组合上，调节pH值可减轻褐化。在初始培养时把植物的外植体置于不适合酚类合成的条件下，如在黑暗或弱光和温度稍低的条件下培养可抑制酚类的氧化。在卡特兰开始培养时，温度保持在15～20℃，培养基pH值调到5.5有助于减轻褐化。也可添加抗褐化剂与吸附剂，防止褐化。

4．外植体的连续转移

在初代培养前期，外植体每隔1～2d转移到新鲜的培养基上2～3次，在某些情况下可以缓解褐化，这段时间内外植体的伤口愈合，外渗停止。如兰花、黑莓山月桂树、无花果、核桃、瑞香、大花飞燕草、紫叶黄栌茎尖或腋芽培养中可使用这个方法。在番茄原生质体培养中不断添加新鲜的培养液以减轻褐化现象。但在红豆杉中，继代培养的新鲜培养液对外植体释放醌类物质有刺激作用，可能是与新鲜培养基中的氧气充足促进了PPO活性有关。

5．添加褐变抑制剂与吸附剂

抗坏血酸等和二氨基二硫代甲酸钠、2-巯基苯并噻唑、氯化钠等都是PPO的抑制剂。聚乙烯吡咯烷酮（PVP）是酚类物质的专一性吸附剂，活性炭是一种吸附性较强的无机吸附剂，能吸附各种微量物质和微小颗粒。

植物组织培养过程中褐变死亡，是一种较普遍存在的现象，也比较复杂，至今褐变的机理尚不确定，因此，需要进一步深入研究。