组培苗污染控制方法与成本分析

一、组织培养中的污染及其控制

植物组织培养过程中的污染是指微生物进入培养体系，并迅速滋生危害培养物。污染可以发生在外植体上，更多的是使外植体周围的培养基甚至整个培养基被浸染，与培养物争夺营养，产生有害的物质，最终导致植物材料发生病害或死亡，造成组织培养的失败。据报道，在组培苗工厂化生产中，污染每增加5%，成本将递增10%以上，当污染率达30%时，就会亏损。

造成污染最常见的微生物是细菌和真菌，有时也可以是酵母菌，以真菌的危害最大。细菌属单细胞生物，因此细菌的菌落有自己的特征，一般呈现湿润、光滑、黏稠、似鼻涕状。真菌广泛分布于地球表面，其菌落除颜色外其外观结构可归纳为丝绒状、毡状、絮状等等，就菌落大小来说，有的种扩展到整个培养皿，有的种则有一定的局限性。由于不同真菌的孢子颜色不同，真菌菌落也就呈现各种不同的颜色，许多真菌还能产生色素分泌到培养基中去，致使菌落的背面也带有颜色。

虽然微生物进入培养体系，防控难度大，但还是有规律可循。污染的途径主要是原始材料带菌、培养基或接种工具灭菌不彻底、无菌操作不规范及环境洁净度差。从操作程序上说，三个阶段都可以轻易地被微生物污染：前期准备阶段，包括培养基、器皿灭菌不彻底，外植体的选择不当与消毒不彻底；无菌操作阶段，包括无菌操作室灭菌和超净工作台洁净度达不到要求、操作不规范、操作工具的消毒不彻底等；培养阶段，培养环境不清洁和培养体系意外开放等。特别是在一些组织培养生产中，培养程序化，一旦发生重复性污染，往往是某个固定环节的失误造成的，通过观察污染的表观现象，可以快速寻找到导致污染的原因，这样可以大大节省人力和成本。

开卷有益

各种具体污染原因的经验分析：①若污染菌类是零星分散在培养基中，则多为操作动作缓慢导致开瓶时间太久、接种台物品杂乱或操作中心离人体太近等原因。②若菌类是从材料周围长起，则多是外植物体或接种用具灭菌不彻底引起，这种污染在培养1～3天内即表现出来；③若菌类从材料表面长起，而不是从培养基长起，且发生在5天以后，则多半是材料内生菌引起的；④若从培养基表面以下开始长菌，发生时间较早，且有从里向外的趋势，则是切口引起的污染，原因可能是外植体消毒后，未剪去两端切口或虽剪但接种器具带菌。因此将污染后的表观现象与引起污染的原因对应起来，就有利于快速找到污染的原因并采取针对性措施加以防治。

组织培养中的污染是可控可防的，除了要特别加强操作人员的培训，一切按操作规程办外，应十分重视两大环节：外植体的消毒和环境的洁净。

（一）外植体的消毒及其污染控制

1．外植体的处理和消毒

外植体污染是组织培养中众多污染途径中最难解决的一个。其具体方法是从选择消毒剂的种类、消毒剂浓度与消毒时间方面进行试验，得到一个最佳的消毒方案。

2．有内生菌的外植体的消毒

植物内生细菌是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织的细胞间隙或细胞内的真菌和细菌。由于材料内部（细胞内或细胞间）的内生细菌不能被一般的表面消毒方法所清除，随着材料带入培养过程，引起污染，被称为内生细菌污染或内源细菌污染。据报道，对于一种植物而言，从中分离到的内生真菌和内生细菌通常为数种至数十种，有的甚至多达数百种。在热带植物中，内生菌的这种多样性更为突出。生长在高温多雨的热带、亚热带植物和多年生木本植物容易表现为内生细菌污染。在某些植物初代培养或前几代的继代培养中存在的污染，但并不形成明显的菌落，而只在培养基内部形成“丝状物”、“晕状物”，不易被肉眼察觉，随着继代培养次数的增加，菌量逐渐累积，才在培养基上显现出来。内生细菌引起的危害主要包括在早期导致培养失败，增殖效率的降低，培养物生长减缓，玻璃苗增加等；在后期导致试管苗移栽困难和死亡，有时污染也会引起培养物的遗传变异。

3．内生细菌污染的控制措施

（1）对母树的预处理(www.xing528.com)

具体措施包括：改善植株栽培环境，尽可能利用温室或人工气候室生长的植株作接种的材料，以减少表面和内生细菌的污染；在采集外植体前对母树喷布杀菌剂或抗生素，如庆大霉素（gentamycin）、敌菌丹（captatol）或异菌脲（iprodione）等。

（2）对母枝或外植体的预处理

具体措施包括：促发新枝，即将田间采回的枝条在人工气候箱内培养促发新枝，用新抽的嫩枝作为外植体；也可黄化处理，在无菌条件下对采自田间的枝条进行暗培养，待抽出徒长的黄化枝条时取材；热击处理，如将美丽百合（lilium speciosum）的鳞茎外植体放入试管中进行43℃热击处理；用抗生素进行预培养，如对相思树的芽和茎段灭菌时，用皂液刷洗和乙醇杀菌后，转入0.2%苯菌灵（benlnete）和0.2%链霉素溶液中，在摇床上振荡过夜，再用80%乙醇和0.1%升汞分别杀菌1min和15min，可获得满意的消毒效果。

（3）改进消毒方法

具体措施包括：真空减压消毒，利用真空减压抽走植物组织中的空气使消毒剂更易侵入，从而增强杀菌效果；磁力搅拌、超声波振动处理，为减少在外植体表面形成的气泡，在浸泡时还可采用磁力搅拌和超声波振动的方法增强杀菌效果；多次消毒（消毒）法，用饱和香皂水（比普通洗衣皂碱性弱）对番木瓜侧芽浸泡20～30min，再用0.1%高锰酸钾溶液处理5min，接着进行消毒处理，然后用0.7%次氯酸钠加0.1%升汞消毒，最后用500mg·L^－1先锋霉素或羧苄西林的无菌水洗，污染率降低50%。

抗生素虽然在植物组培中应用对污染控制有很好的作用，但问题也较多：如不稳定，遇酸、碱或加热都易分解而失活；易产生抗药性，停用后污染率又显著上升；高浓度的抗生素会影响植物的生长。以上因素都会影响抗生素在植物组培中应用。

（二）组织培养中的环境污染及其控制

1．组织培养中的环境污染

据监测，组织培养环境中的污染主要是由真菌和细菌引起的：真菌主要是青霉、木霉、曲霉；细菌主要是球菌和芽孢杆菌。由于地域不同或组培室所处环境或位置的不同，其种类有所差异。组培环境空气中真菌数量月份间相差很大，6、7、10月空气中真菌数量较多，其他月份数量较少。瓶苗的污染率月份间相差很大，6、7、10月是组培苗污染高发月份，其他月份较低，组培苗污染情况与环境空气中的真菌数量存在正相关的关系。

2．组织培养中的环境污染的控制

接种室与培养室要定期消毒与净化，用高锰酸钾和甲醛每三月熏蒸1次（甲醛4～6ml／m³，高锰酸钾3～6g／m³）。熏蒸可使环境中的真菌减少87%以上。接种前工作台开紫外灯30min以上。培养室的相对湿度应控制在70%左右，每次接种前先用70%酒精在室内喷雾使空气中的细菌和真菌孢子沉降，接种前后都要用70%的酒精或者1∶50的新洁尔灭湿性消毒溶液擦洗超净工作台。接种后要及时打清洁，用2%的新洁尔灭溶液擦洗地面、墙壁和门窗。环境污染的控制是硬道理，措施虽普通但应极严格，必须制定相应的环境污染控制的规章制度，使环境污染的控制处于常态化之中。

3．继代培养中的污染控制

在继代培养中出现污染，一方面是由于继代转接操作不规范起的，另一方面由于初代培养使用的是营养相对简单的培养基，可能使污染不易表现出来，也可能是培养室灭菌工作不到位，被螨传播的真菌污染。最有可能的是内生菌，随着继代次数增加，菌量逐渐累积发展，在培养基上表现出来，因此，在继代培养基中加入抗生素或在继代培养基中撤销一些有机物如VB_1、VB_6、烟酸等可降低污染率。