植物胚胎培养是指胚或胚器官(如子房、胚珠)在离体无菌条件下,发育成幼苗的技术,包括幼胚培养、成熟胚培养、胚珠培养、子房培养、胚乳培养等。
胚胎培养已有近百年的历史。1904年的Haning最早成功地培养了萝卜和辣椒的胚,并萌发形成小苗。20世纪30年代成功地把兰科植物的胚培养成小植株。40年代在苹果、桃、柑橘、梨、葡萄、山楂、马铃薯、甘蓝与大白菜的种间杂种的胚胎培养、胚乳培养及子房与胚珠培养方面均取得了不同程度的进展。
胚胎培养的意义在于:
第一,打破休眠,如Arrillaga等(1992)用各种方法处理未经层积处理的白蜡完整种子,都不能明显提高种子的发芽率,但将种子浸泡24h后,取出胚进行离体的胚培养,胚萌发率高达90%以上。因此他们认为离体胚培养可以解除种子休眠。
第二,克服远缘杂种的不育性,获得稀有杂种。程桂琴等(2000)通过离体胚培养成功地获得了纤毛鹅冠草和5个四倍体小麦种(品种)的属间杂种植株及愈伤组织,有效地克服了纤毛鹅冠草和四倍体小麦杂种胚发育小的问题。
第三,获得单倍体和多倍体植株,如孙敬三等利用“小麦×玉米”杂交,获得了小麦单倍体。再如伊华林等以柑橘异源四倍体杂种为父本与单胚的二倍体柑橘类型杂交,通过幼胚获得了三倍体植株。
第四,使胚发育不全的植物获得后代,如Musa balbisiana是商品香蕉的1个野生亲缘物种,其种子在自然条件下不能萌发,然而通过离体胚的培养很容易产生幼苗。此外还可缩短育种年限等。
(一)离体胚培养
离体胚培养的一般流程如图4-13所示,先将子房消毒,剥离胚珠,再在解剖镜下剥离胚,接种到已经灭菌的合适培养基上,最后在适宜的环境中进行培养。
图4-13 胚培养流程(www.xing528.com)
离体胚培养包括胚胎发生过程中不同发育期的胚,一般可分为成熟胚和幼胚培养。
1.成熟胚培养
成熟胚培养是指对子叶期后至发育完全的胚所进行的无菌培养。由于这种胚的各个部分发育基本上完成并且含有较多的养料(如肥厚的子叶),培养就较易成功,一般在基本培养基上就能正常生长成幼苗。常用的培养基有:White培养基、Tukey培养基或MS培养基。再加入无机盐、糖(1%~2%)和生长辅助物质(激素、AA、活性炭、维生素等)。
无菌操作与其他培养大同小异,即将成熟或未成熟种子浸泡在70%~75%酒精30~60s,用无菌水漂洗3~4次,剥离出胚并接种在适当的培养基上培养,最后在培养室中培养。
2.幼胚(未成熟胚)培养
幼胚是指子叶期以前的幼小胚。心形期胚或更早期的胚(长度仅0.1~0.2mm)由于形态结构及生理均未成熟,因此较成熟胚培养困难得多。由于幼胚培养在远缘杂交育种上有极大的利用价值,其研究应用越来越深入广泛。幼胚培养成功的有大麦、荠菜、甘蔗、甜菜、胡萝卜等。
幼胚培养成功的关键,是提供幼胚所必需的营养和环境条件。影响条件因子有培养基养分的种类与含量及可利用率、生物调节物质的种类与浓度及其比例、温度、光照强度与光照时间等(具体可参阅相关文献)。
(二)子房、胚珠和胚乳的培养
子房培养就是将花蕾消毒后,在无菌的环境中剥去花被,取出完整子房,接种到培养基中进行培养的过程,分为未授粉子房的培养与授粉子房的培养。对于前者,一般要求在开花前1~5d在大田摘取花蕾,回到实验室进行饱和肥皂粉液浸泡5min,流水冲洗5min,70%~75%酒精30s,0.2%升汞消毒10min,无菌水漂洗6次(第1次搅拌30s,其他几次停留3min),进入无菌接种,接种完毕后将其培养在25℃、光照1000lx左右、每天光照时间8~10h,即可成苗。对于后者,则可在授粉后采集子房,带回实验室,再在浓洗衣粉溶液中3~5min,流水冲洗5min,70%~75%酒精10s,0.1%升汞消毒10min,无菌水漂洗6次(第1次搅拌30s,其他几次停留3min),无菌接种,培养。具体如表4-4所示。
表4-4 子房、胚珠和胚乳培养的对比(引自王振龙等,2007)
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