叶的培养技巧与注意事项

三、叶的培养

离体叶的培养是指包括叶原基、叶柄、叶鞘、叶片、子叶在内的叶组织的无菌培养。叶是植物进行光合作用的自养器官，又是某些植物的繁殖器官，因此离体叶组织、细胞的培养不仅可用于研究形态建成、光合作用、叶绿素形成等理论问题，而且可为叶片原生质体培养和原生质体融合的研究提供理论依据；可以建立快速无性繁殖系，成为提高不易繁殖的植物繁殖效率的有效途径；利用叶细胞培养物的自然和人工诱变处理，可以筛选出突变体而应用于育种实践。现以陈秋芳（2007）菘蓝叶片离体培养与试管无性系的建立为例，说明叶培养的一般过程：

取菘蓝幼嫩叶片→用稀的洗洁精水冲洗后再用自来水清洗干净→转到超净工作台内用70%的酒精消毒30s→无菌水漂洗3次→10%的次氯酸钠（有效氯为0.7%）消毒3min，无菌水漂洗5次→将叶片切成0.5cm²的小块，接种MS＋BA0.5mg·L^－1＋NAA 1mg·L^－1或M＋SNAA1mg·L^－1培养基上，每瓶接种10块叶片→在温度为25℃左右、光照12h·d^－1、光照强度1500～2000lx下培养。10d左右后，叶片开始增厚—肿胀—鼓起，20d左右有不定芽原基从叶片边缘产生，30d不定芽（已经萌发成嫩梢）高度可以达到3～4cm。如果还要继续增殖，可以在原培养基上进行扩繁或对此培养基改进后再扩繁，使之数量上不断增加，从而壮苗生根，驯化移栽。

（一）常规培养方法

1．取材与消毒

从生长健壮无病的植株上选取未充分展开的幼嫩叶片，进行常规消毒（消毒时间可据材料的老嫩和质地而定）。对一些粗糙或带茸毛的叶片可预先用蘸有70%～75%酒精的棉球擦拭叶片两面或用饱和洗衣粉液洗刷后，再用消毒剂消毒，并且要适当延长消毒时间；而幼嫩的叶片消毒时间宜短。

2．无菌接种

将已经消毒的叶组织转入铺有无菌滤纸的培养皿内，然后将叶组织切成约0.5cm²的小块或薄片（如叶柄和子叶），接种至MS、N6等基本培养基上。接种时叶面朝上，因叶背含有较多的气孔、角质层薄、海绵组织排列疏松，有利营养物进入叶内，但当叶裂缺较多且起伏不平时，则叶切块宜小且叶面朝下较为适宜。接种后，将培养物放置在约25℃、光强1500～3000lx和光照10～12h·d^－1培养室内进行培养。

3．诱导出初代培养产物

经过上述一段时间培养后，通常就能看到有愈伤组织、不定芽、原球茎或胚状体等中间繁殖体长出（具体见模块2）。

4．增殖培养

当形成了中间繁殖体后，往往这些中间繁殖体的数量很有限，需要进一步扩大。这时可对这些初代培养产物进行分割，再转接至继代（或称增殖）培养基上，然后转到适宜的环境中进行培养。

5．壮苗生根

当中间繁殖体数量足够多时，这时就要考虑分流：一方面继续扩大中间繁殖体，另一方面就要促进中间繁殖体形成完整的试管苗用于生产。这一过程中可能会发现有些无根苗比较弱小，这时就要对这些弱小苗进行培壮的过渡阶段，这个过程叫壮苗。壮苗后再转接到生根培养基上进行生根，使其形成完整的试管苗。(www.xing528.com)

6．驯化移栽

当形成健壮完整的试管苗后，就可以进行驯化、移栽。

（二）影响叶培养的因素

1．激素

离体叶的培养较茎尖、茎段培养难度大，常常需要多种激素的配合使用，并且不同培养阶段需要更换不同的激素组合。如杏离体叶培养使用1／2MS培养基，ZT与2，4-D的组合可诱导其愈伤组织的产生，KT与NAA的组合可从愈伤组织中诱导不定芽的产生；驱蚊草在MS＋6-BA 0.5～1.0mg·L^－1＋IAA 0.05～0.2mg·L^－1培养基中，可以直接使叶片产生愈伤组织，并分化出芽。需要注意的是2，4-D对某些植物的愈伤组织诱导非常有效，但如果使用浓度不当，将会对后期的分化产生抑制作用。

2．叶龄

一般子叶较叶片易于分化；幼叶较成熟叶脱分化时间短，分化能力强，而且可从不同部位成苗。

3．极性与损伤

离体叶培养一般要求上表皮朝上平放于培养基上，这样易于培养成活。如烟草的一些品种的叶片背面朝上放置时，就不生长、死亡或只形成愈伤组织而没有器官的分化。但有些叶由于叶背叶脉突起，这时可以考虑叶面朝下，并且要切割得小一些，这样可使叶块紧贴培养基。另外，切割叶外植体时所带来的损伤对愈伤组织的形成具有一定的影响。大多数植物的愈伤组织首先从叶切口处形成或在切口处直接产生不定芽芽苗。

4．叶脉

离体叶培养的外植体一般要求带叶脉，尤其是大的叶脉，因为大的叶脉含有较完整的维管束，而完整的维管束中间有形成层，它是次生分生组织，所以很容易恢复分裂能力，进而形成中间繁殖体。如杨树、中华猕猴桃植物常在叶柄和叶脉的切口处容易形成愈伤组织和分化成苗。

除上述之外，植物种类、品种间在叶组织培养特性上也存在着一定的差异。