根的培养及无性繁殖系的建立方法

一、根的培养

根培养一般是指利用种子在无菌环境中萌发的根进行组织培养。但也有人直接从土壤中挖取根的。离体根的培养是进行根系生理代谢研究最优良的实验体系。因为根系生长迅速，代谢旺盛，变异小，可以通过培养基的调控来研究其生长和代谢的变化。一方面，在工厂化生物反应器系统中通过工艺调控实现根的大规模生产，可以随时随地生产离体根的培养物，进行药物、微量活性物质及一系列次生代谢产物的工厂化生产。另一方面，通过根细胞的培养可再生植株，用于农业生产。此外，由根细胞可再生成植株，不仅证明根细胞的全能性，而且也能产生无性繁殖系，用于生产实践。其培养方法如图4-1所示。

图4-1　器官培养的常规工艺流程

根的常规培养可分以下几个阶段：

第一，筛选培养基。多选择无机离子浓度低的White培养基，其他培养基如MS、B等也可采用，但必须将其浓度稀释到2／3或1／2。

第二，建立根无性繁殖系。将种子进行表面消毒，在无菌条件下萌发，待根伸长后从根尖一端切取长1.2cm的根尖，接种于培养基中。培养条件为黑暗和25～27℃，这些根的培养物生长甚快，几天后发育出侧根。待侧根生长约1周后，即切取侧根的根尖进行扩大培养，它们又迅速生长并长出侧根，又可切下进行培养，如此反复，就可得到从单个根尖衍生而来的离体根的无性系。这种根可用来进行根系生理生化和代谢方面的实验研究。

第三，植株再生培养。根段的离体培养也可以用来再生植株。第一步诱导形成愈伤组织。第二步在再分化培养基上诱导芽的分化，在愈伤组织上分化成小植株。

现以诱导茶树根愈伤组织及发状根（彭正云，2004）为例具体说明离体根培养的过程。(www.xing528.com)

1．外植体的采集与处理

根培养的外植体一般取自无菌种子发芽产生的幼根或植株根系经消毒处理后的切段。但此例是从茶园中直接挖取。挖回的根用自来水冲洗干净后，用70%的乙醇中浸泡30s，再用0.25%的HgCl₂溶液浸泡10min，最后用无菌水漂洗3次，最后将根切成长0.5cm左右的根段作为外植体。

2．根无性繁殖系的建立

将上述切好的根段接种于表4-1中的A培养基中，35d后，可看到愈伤组织被诱导出来，当愈伤组织生长至肉眼可见时需要及时转移至新鲜培养基A上培养，否则以后生长十分缓慢甚至停止生长。转接10d后，会长出新的淡黄色愈伤组织，愈伤组织再转接到表4-1中的B培养基上进行继代培养，其生长比在A培养基上培养的旺盛。当愈伤组织长到一定数量后，就可转接到C培养基进行发状根（茶树发状根可生产茶叶中的有用物质）的分化，当长出发状根后可以接种至D培养基进行增殖培养。总体上说，这种培养方案还算初步成功。

表4-1　茶树根愈伤组织和发状根诱导培养基配方

3．继代培养与驯化移栽

如果想使发状根或愈伤组织再分化为完整的植株，尚需进一步研究一种再分化培养基，让其形成完整的试管苗。形成完整试管苗后，再经过驯化移栽，就可栽植到大田中。