生产实例：治疗心脏病等症的薯蓣皂苷元的优化溶剂系统和平均含量分析

14.3.5　生产实例

1.薤白中的甾体皂苷

薤白为百合科植物小根蒜（A llium macrostemon）的干燥鳞茎。近代临床及药理研究表明，薤白中含有的甲基烯丙基二硫、二甲基三硫及薤白苷E、F等成分具有强烈的抑制血小板聚集作用，薤白提取物能显著抑制动脉粥样硬化的形成，对血清总脂、β-脂蛋白和总胆固醇都有较明显的降低作用，具有抗氧化、抗菌、镇痛、抗癌等作用。临床用于治疗心绞痛、高血脂、心脏病性哮喘、冠心病引发的呼吸困难、腹痛，以及食欲不振等病症。

薤白的主要化学成分为甾体皂苷，如薤白苷A、D、E、F、J、K、L（macrostemonside A、D、E、F、J、K、L）等，其皂苷元有替告皂苷元（tigogenin）、异菝葜皂苷元（smilagenin）、沙漠皂苷元（samogcnin）等。

（1）薤白苷的结构式

（2）理化性质

1）性状：薤白苷A、D、E、F、J、K、L等化学成分为白色粉末或白色无定形粉末。

2）溶解性：薤白苷A、D、E、F、J、K、L等均可溶于甲醇、乙醇、吡啶等溶剂，难溶于亲脂性有机溶剂。

（3）薤白中薤白苷J的生产工艺

【工艺原理】

根据薤白中甾体皂苷的溶解性，以甲醇或乙醇为溶剂，提取甾体皂苷及皂苷元；利用其在不同溶剂中的溶解度不同进行初步分离，然后运用大孔吸附树脂柱色谱、硅胶柱色谱方法分离，进一步用反相中低压Lobar柱色谱、制备HPLC等分离手段达到分离的目的。

【操作过程及工艺条件】

1）醇提-浓缩：薤白鳞茎36kg，加75%乙醇回流提取，回收溶剂，得浸膏。

2）液-液萃取：加水分散，依次用三氯甲烷、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，取正丁醇萃取液，回收溶剂，得正丁醇提取物。

3）大孔吸附树脂纯化：取正丁醇提取物，加水分散，通过大孔吸附树脂柱，先用水洗除去糖类成分，再用甲醇洗脱得总皂苷。

4）硅胶柱色谱分离：总皂苷经硅胶柱色谱，以不同比例的三氯甲烷-甲醇作洗脱剂进行梯度洗脱，分段收集，合并相同组分，得5个组分（Ⅰ～Ⅴ）。

5）大孔吸附树脂分离：取组分Ⅲ，再经大孔吸附树脂柱，依次以水和20%甲醇洗脱，回收溶剂，得20%甲醇洗脱物。

6）硅胶柱色谱分离：20%甲醇洗脱物再经硅胶柱色谱，以三氯甲烷-甲醇-水（80∶20∶5）下层洗脱得极性较大部位。

7）中压柱色谱分离：取极性较大部位，再经中低压Lobar柱（Rp-8）反复柱色谱分离，流动相为甲醇-水（7∶3），分离后用Rp-18柱纯化，收集极性较大部位。

8）大孔吸附树脂-制备H PLC分离：极性较大部分再经大孔吸附树脂柱色谱，以40%～80%甲醇洗脱，采用制备HPLC分离，得薤白苷J（10mg）。

【生产工艺流程】

【工艺注释】

1）以75%乙醇提取，提取方法可采用渗漉法、回流提取法和超声波提取法，回收乙醇得浸膏。

2）醇浸膏用适量水稀释后依次用三氯甲烷、乙酸乙酯和水饱和正丁醇萃取，使不同极性的化合物彼此分离，萃取时应遵循少量多次原则，使萃取完全。

3）采用中低压Lobar柱色谱、制备H PLC等分离方法分离正丁醇萃取部分极性较大的皂苷类成分。

（4）薤白中皂苷元的生产工艺

【工艺原理】

皂苷可溶于水和醇类有机溶剂，难溶于丙酮和亲脂性有机溶剂；皂苷元可溶于有机溶剂，难溶于水，依据两者性质异同，用醇类溶剂进行提取，液-液萃取分离。

【操作过程及工艺条件】

1）醇提：取新鲜的长梗薤白鳞茎8kg粉碎后，以90%乙醇回流提取，提取液减压回收溶剂得总提取物。

2）水溶-过滤：取总提取物加水溶解，过滤，得水不溶物（63.8g）和水溶液。

3）硅胶柱色谱分离：取水不溶物60g经硅胶柱色谱，以溶剂系统A、B、C、D梯度洗脱，共分得5个组分（Ⅰ～Ⅴ）。对组分Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ再分别进行反复硅胶柱色谱，得提果皂苷元和吉托皂苷元。

【生产工艺流程】

【工艺注释】

1）采用乙醇为提取溶剂，可同时提取皂苷和皂苷元，利用两者在水中溶解度的差异，使之分离。

2）过滤后的水溶液经水饱和正丁醇萃取得正丁醇萃取物，经硅胶柱色谱，以溶剂系统H、I、甲醇梯度洗脱，共分得6个组分（Ⅰ′～Ⅵ′），组分Ⅲ′经甲醇重结晶得甾体皂苷。

3）溶剂系统：A：三氯甲烷-甲醇-水（10∶1∶0.1）下层；B：三氯甲烷-甲醇-水（6∶1∶0.1）下层；C：三氯甲烷-甲醇-水（5∶1∶0.1）；D：三氯甲烷-甲醇-水（3∶2∶0.1）；H：乙酸乙酯-甲醇-水（5∶1∶0.5）；I：乙酸乙酯-甲醇-水（4∶1∶0.8）。

2.穿龙薯蓣中的甾体皂苷

穿龙薯蓣为薯蓣科薯蓣属植物穿龙薯蓣（Dioscorea nipponica）的根茎。近代临床及药理研究表明，穿龙薯蓣总皂苷能显著降低家兔血胆固醇含量，改善冠状循环，其水解产物薯蓣皂苷元对高岭土引起的足肿胀有抑制作用，也是近代制药工业中合成甾体激素和甾体避孕药的重要原料。穿龙薯蓣水溶液具有镇咳、祛痰、平喘作用，此外，还有明显的抗流感病毒作用，对金黄色葡萄球菌、八叠球菌、大肠杆菌、卡他球菌、脑膜炎双球菌及甲型链球菌等均有较明显的抑制作用。

主要成分为薯蓣皂苷（dioscin）、纤细薯蓣皂苷（gracillin）和穿龙薯蓣皂苷Dc。总皂苷水解产生薯蓣皂苷元（diosgenin），平均含量约为0.93%～2.26%。此外，还含有对羟苄基酒石酸（piscidic acid），尚含少量的25-D-螺甾-3，5-二烯（25-D-spirosta-3，5-diene）。

（1）穿龙薯蓣中不同薯蓣皂苷和薯蓣皂苷元的结构式

（2）理化性质

1）性状：薯蓣皂苷为无定形粉末或白色针状结晶，熔点275～277℃（分解）；纤细薯蓣皂苷为无色菱形结晶（甲醇），熔点287～289℃（分解），［α］²_D⁰＝—86.2°（二甲基甲酰胺）；穿龙薯蓣皂苷Dc为无色针状结晶，熔点216～218℃（分解），［α］²_D⁰＝—96.2°（吡啶）；薯蓣皂苷元为白色结晶（乙醇），熔点204～207℃，［α］²_D⁵＝—129.3°（CHCl₃）。

2）溶解性：薯蓣皂苷不溶于水，可溶于乙醇、甲醇，微溶于丙酮、戊醇，难溶于乙醚、苯等弱极性有机溶剂；纤细薯蓣皂苷可溶于甲醇；穿龙薯蓣皂苷Dc易溶于吡啶，可溶于甲醇、乙醇和水；薯蓣皂苷元可溶于常用的有机溶剂如甲醇、乙醇、乙醚、石油醚及醋酸中，不溶于水。

（3）薯蓣皂苷的生产工艺

【工艺原理】

利用薯蓣皂苷的溶解性，采用溶剂法进行提取，多以甲醇或乙醇作为提取溶剂，提取方法可采用浸提、回流或超声等方法。利用皂苷可溶于乙醇、难溶于丙酮的性质进行醇提-丙酮沉淀处理；利用皂苷对正丁醇和大孔吸附树脂的特殊选择性进一步分离纯化，得到粗皂苷。分离薯蓣皂苷亦采用硅胶柱色谱、制备HPLC、TLC法等分离方法。

1）乙醇浸提-有机溶剂萃取法

【操作过程及工艺条件】

①粉碎-过筛：取穿龙薯蓣的干燥根茎，粉碎，过20目筛；②脱脂-醇提：取过筛粉末装入逆流渗漉浸提器中，先以轻汽油浸提脂溶性物质，然后再以乙醇逆流浸提总皂苷，浸提液控制出液系数在5以下；③析晶-过滤：将乙醇浸提液泵入减压蒸馏罐中，回收乙醇至小体积，冷却后析出部分皂苷，过滤并收集该部分皂苷；④浓缩-水溶：滤液回收乙醇至干，残渣加水分散；⑤萃取-浓缩：用水饱和正丁醇溶液逆流萃取含皂苷的水溶液，分取正丁醇萃取液，回收溶剂至小体积；⑥析晶-过滤：加轻汽油调节正丁醇溶液的极性，放置，析出皂苷，过滤；⑦合并-干燥：合并所得各部分皂苷，低温干燥得薯蓣总皂苷。

【生产工艺流程】

【工艺注释】

①逆流渗漉法是药材与溶剂在浸出容器中，沿相反方向运动，连续而充分地进行提取的一种方法，具有溶剂利用率高、有效成分浸出完全等特点，控制溶剂流速与药材逆向流动速度，可得到所需浓度的浸提液。本工艺中浸提液控制出液系数应在5以下，可充分浸出有效成分。②通过二次回收乙醇操作可获得较高纯度和收率的皂苷。③利用正丁醇对甾体皂苷的特殊溶解性进行分离纯化。

2）乙醇超声提取-逆流分溶法

【操作过程及工艺条件】

①乙醇超声提取：取药材粉末约5kg，加入10倍量35%乙醇，超声处理30分钟，过滤；②浓缩：减压回收溶剂得乙醇提取物；③逆流分溶法除杂：取乙醇提取物，加水分散，以乙酸乙酯逆流分溶；④逆流分溶法分离：除杂水溶液以水饱和的正丁醇逆流分溶；⑤回收溶剂：收集正丁醇层，回收溶剂，得薯蓣总皂苷。

【生产工艺流程】

【工艺注释】

①根据薯蓣皂苷的溶解性，选用低浓度的乙醇作为提取溶剂；②采用超声波辅助提取法可促使溶剂深入植物细胞，加速植物体中皂苷的溶出，从而提高收率；③利用DCC法分离纯化薯蓣皂苷时，应遵循少量多次的原则，使提取完全；④该方法操作简单，缩短了提取时间，所得的薯蓣皂苷纯度较高。

3）溶剂提取-沉降剂-大孔吸附树脂法

【操作过程及工艺条件】

①水浸-磨碎-过筛：取穿龙薯蓣饮片，加水并用NaOH调pH10，浸泡12小时，将植物体带水于球磨机中磨碎，过40目筛，得筛上物和滤液；②水洗-过滤：用蒸馏水多次洗涤筛上物，过滤，得滤渣和滤液，合并滤液，静置4小时，得上清液和沉淀物；③浓缩-澄清：上清液经减压浓缩后，加ZTC-Ⅱ型澄清剂得到澄清液；④大孔吸附树脂纯化：澄清液再经大孔吸附树脂富集纯化得水溶性甾体皂苷；⑤醇提：将过滤后的粗滤渣用75%乙醇（料液比1∶10），55℃回流提取2小时，重复2次后收集醇提取液，同时将上述沉淀物以75%乙醇洗涤多次至醇提取液无色，合并上述乙醇提取液；⑥浓缩-纯化：醇提取液减压回收乙醇，经澄清剂澄清后制得水不溶性甾体皂苷。

【生产工艺流程】

【工艺注释】

①加蒸馏水，调pH10，浸泡12小时，将植物体带水于球磨机中磨碎，不能过细，否则滤液中有纤维残渣；②工艺采用静置4小时后过滤，使滤液中的上清液和沉淀物分开，还可以采用离心等方法进行固-液分离；③加入ZTC-Ⅱ型澄清剂，利用其絮凝、吸附等特性，可除去药液中粒度较大及有沉淀趋势的悬浮颗粒，有效地去除杂质，药液澄清效果好。

4）液液萃取-硅胶柱色谱-制备H PLC及制备TLC法

【操作过程及工艺条件】

①水分散：取穿龙薯蓣总皂苷约30g，加水使之溶散；②萃取-浓缩：水溶液加NaCl饱和后，用5% HCl调pH值至5左右，再用水饱和的正丁醇萃取多次，合并萃取液，减压回收溶剂；③析晶-重结晶：浓缩液加丙酮，析出沉淀，过滤，沉淀经甲醇-丙酮重结晶，得淡黄色粉末约10g；④硅胶干柱色谱分离：取上述淡黄色粉末约10g，用400g硅胶干柱色谱，用CHCl₃ MeOHH₂ O（7∶3∶0.5）展开，切割成3份，得3种混合皂苷A、B和C，其中皂苷C为极性大的皂苷；⑤制备TLC分离：取混合皂苷C 0.5g，制成5%的乙醇溶液，用10μL微量点样管在HSG薄层板上点成线条状，以CHCl₃ MeOH-H₂ O（65∶35∶10下层）为展开剂二次展开，取出，晾干，置碘缸中显色，可见两条主色带，刮板；⑥重结晶：两条主色带分别经无水乙醇重结晶后得皂苷Ⅰ和Ⅱ各100mg；⑦制备HPLC分离：取皂苷Ⅱ，经HPLC分离纯化，得穿龙薯蓣皂苷Dc（15mg）。

【生产工艺流程】(www.xing528.com)

【工艺注释】

①通过上述工艺得到一个水溶性甾体皂苷：薯蓣皂苷元-3-O-［α-L-鼠李糖（1→3）-α-L-鼠李糖（1→4）-α-L-鼠李糖（1→3）］-βD-葡萄糖苷，命名为穿龙薯蓣皂苷Dc；②在正丁醇萃取之前加入NaCl，通过盐析作用使皂苷尽可能完全地转溶于正丁醇中，利用甲醇-丙酮沉淀法，进行皂苷的纯化。

（4）薯蓣皂苷元的生产工艺

薯蓣皂苷元是异螺甾烷的衍生物，一般以苷的形式存在于薯蓣属植物中，即在C₃和C₂₆通过苷键与糖链相连进而与植物细胞壁紧密相连。目前常用的薯蓣皂苷元的提取方法主要有酸水解法、两相溶剂水解法、酶解提取法和超临界流体萃取法等。薯蓣皂苷元的分离纯化一般采用硅胶柱色谱法、甲醇或丙酮重结晶法。

1）酸水解-有机溶剂提取法

【工艺原理】

利用薯蓣皂苷元不溶于水，易溶于有机溶剂的性质进行提取分离，穿龙薯蓣中含有薯蓣皂苷，薯蓣皂苷是由薯蓣皂苷元和糖组成的，故可利用苷键裂解的方式获得薯蓣皂苷元。

【操作过程及工艺条件】

①酸水解：取穿龙薯蓣饮片或干燥根粗粉，加水浸透后，加3.5倍量水，加浓硫酸使浓度达3%，通水蒸气加压水解8小时；②水洗-干燥-粉碎：水解后的原料用水洗去酸液，干燥后粗粉碎，干燥粉末含水量不超过6%；③提取：取干燥粉末，加活性炭，然后加6倍量汽油，连续回流；④浓缩-析晶：提取液回收溶剂，室温放置，使结晶完全析出，离心，得粗制薯蓣皂苷元；⑤重结晶：将粗制品溶于乙醇或丙酮，趁热过滤，放置析晶，即得薯蓣皂苷元纯品。

【生产工艺流程】

【工艺注释】

①原料经酸水解后应充分洗涤，使原料呈中性，以免在烘干时炭化；②干燥水解原料时，应使含水量不超过6%，如果含水量过高，则不利于汽油提取；③连续回流提取过程中，应注意温度的控制，保持汽油微沸即可，温度不宜过高；④此法在工业上已应用多年，缺点是收率较低，且因使用汽油，易发生危险，此外，穿龙薯蓣中的淀粉和纤维素等在相同的条件下被酸水解；⑤本工艺对原料直接进行酸水解，比提取总皂苷后再进行酸水解的工艺路线短、经济；⑥如果在酸水解前先发酵处理，不但能缩短酸水解时间，而且能提高薯蓣皂苷元得率。

2）酶预处理法

【工艺原理】

酶预处理法与自然发酵法类似，即在酸水解前进行酶解淀粉、纤维素的处理工序。

【操作过程及工艺条件】

①酶解：取药材饮片先用5倍量水浸泡，用硫酸调pH5，以每克生药10U的量加入纤维素酶，充分搅拌，置于40℃恒温水浴90分钟，适时搅拌；②酸水解：酶处理后，加水500m l，浓硫酸30m l，回流提取3小时，过滤；③水洗-干燥：滤渣水洗至中性，减压干燥；④提取-浓缩：用石油醚回流提取8小时，提取液回收溶剂至60m l，放置，过滤，烘干；⑤提取-脱色：干燥物加丙酮150m l、活性炭0.5g，回流提取0.5小时，趁热过滤，滤液静置；⑥析晶-抽滤-干燥：滤液静置至结晶完全析出，抽滤，取滤饼于105℃以下干燥，即得薯蓣皂苷元结晶。

【生产工艺流程】

【工艺注释】

①滤渣采用减压干燥，可防止温度过高，滤渣炭化，有效成分被破坏；②另有研究表明用糖化酶或液体曲发酵盾叶薯蓣根茎，一般可以提高薯蓣皂苷元的产率，如用黑曲霉菌株对盾叶薯蓣根茎发酵，产率远高于直接酸水解法和其他发酵法，此方法的优点是操作简单，皂苷元收率高，反应条件也比较温和，保持了有效成分的理化性质。

3）CO₂超临界流体萃取法

【工艺原理】

利用CO₂超临界流体处于临界点附近时对溶质具有独特的溶解性，进行有效成分的分离。

【操作过程及工艺条件】

①浸泡：将穿龙薯蓣根茎先浸泡6小时，可提高薯蓣皂苷元收率；②CO₂超临界流体萃取：在萃取压强35.0M Pa，萃取温度45℃，以乙醇为夹带剂，含量为3%，萃取时间3小时，CO₂流速2L/min的萃取条件下进行等温动态萃取，溶有薯蓣皂苷元的CO₂经减压阀降压后进入分离器中，实现薯蓣皂苷元的分离。萃取物每隔1小时采样一次，直至萃取完全。

【生产工艺流程】

【工艺注释】

①由于皂苷的极性较大，在萃取时一般加入夹带剂，以适当改变流体的极性，乙醇是最常用的夹带剂；②该方法安全、省时、提取率高、无毒、无环境污染，是提取薯蓣皂苷元生产工艺的发展方向，但存在设备一次性投资过大的缺点；③该方法不仅对溶质有较高的溶解能力，而且还可通过改变压力和温度来改变溶解度；④研究证明，利用CO₂超临界流体技术从穿龙薯蓣中提取薯蓣皂苷元，其收率比石油醚提取法提高33%。

4）醇提-有机溶剂萃取-硅胶柱色谱分离法

【工艺原理】

根据薯蓣皂苷元易溶于有机溶剂的性质，采用醇提法提取，根据其极性大小，采用不同极性的溶剂进行萃取，然后用硅胶柱色谱法进行分离。

【操作过程及工艺条件】

①醇提：取穿龙薯蓣地上部分5kg，用70%乙醇回流提取；②浓缩-过滤：醇提液减压回收溶剂至相对密度1.12，过滤；③萃取：滤液用石油醚萃取，减压回收溶剂，得到石油醚提取物；④硅胶干柱色谱分离：取石油醚提取物50g，用1500g硅胶干柱色谱，经石油醚-乙酸乙酯（30∶1～30）洗脱得薯蓣皂苷元。

【生产工艺流程】

【工艺注释】

①采用70%乙醇回流提取，回收乙醇在同品种再利用时非常方便；②提取液减压回收至相对密度1.12，可除去醇不溶物。

【思考题】

1.强心苷的酸水解类型有哪几种？简述其特点及应用。

2.与强心苷共存的水溶液杂质有哪些？提取强心苷时如何除去这些杂质？

3.毛花洋地黄苷甲、乙、丙三者溶解度为什么有差异？

4.比较毛花洋地黄苷丙与西地兰在薄层色谱中其R _f值大小，试解释原因。

5.毛花洋地黄苷丙去乙酰基常采用氢氧化钙或碳酸钾，为什么不采用氢氧化钠？

6.甾体皂苷的提取分离方法有哪些？

7.甾体皂苷元的提取分离方法有哪些？

8.甾体皂苷与强心苷在结构上有何区别？如何用化学方法区别两者？

9.设计用溶剂法分离毛花洋地黄苷甲、乙、丙的工艺流程。

10.设计从某中药中分离甾体皂苷、叶绿素、树脂、蛋白质的工艺流程。

【参考文献】

［1］吴立军.天然药物化学（第5版）［M］.北京：人民卫生出版社，2007：310-349

［2］匡海学.中药化学［M］.北京：中国中医药出版社，2003：262-312

［3］匡海学.中药化学图表解［M］.北京：人民卫生出版社，2008：191-231

［4］刘桂芳，刘大有，王栋，等.中药化学实验及技术［M］.沈阳：辽宁大学出版社，1995：243-255

［5］徐怀德.天然药物提取工艺学［M］.北京：中国轻工业出版社，2008：48-51，360-379

［6］周家驹，谢桂荣，严新建.中药原植物化学成分手册［M］.北京：化学工业出版社，2004：1170，1180，1189，1204

［7］常新全，丁丽霞.中药有效成分分析手册（上、下册）［M］.北京：学苑出版社，2002：1537，1579，2059，2353

［8］吴立军.实用天然有机产物化学［M］.北京：人民卫生出版社，2007：1116-1178

［9］杨云，张晶，陈玉婷.天然药物化学提取分离手册（修订版）［M］.北京：中国中医药出版社，2003：131，579，682

［10］孙文基.天然药物成分提取分离与制备［M］.北京：中国医药科技出版社，1999：135-137，138-141，418-422

［11］方起程.天然药物化学研究［M］.北京：中国协和医科大学出版社，2006：570-602

［12］陈海峰，王乃利，戴毅，等.HPLC测定薤白提取物中呋甾皂苷Ⅰ的含量［J］.中国中药杂志，2006，31（12）：990

［13］唐丽，匡海学，庞满坤，等.长梗薤白鳞茎的化学成分研究［J］.中医药学报，2003，31（1）：22

［14］谢辉，陆兔林，毛春芹.正交法优化薤白提取工艺研究［J］.中成药，2004，26（9）：附1

［15］袁毅，张黎明，王亮亮，等.穿龙薯蓣皂苷的提取及其副产物的分离［J］.天津科技大学学报，2007，22（3）：1

［16］都述虎，刘文英，付铁军，等.穿龙薯蓣总皂苷中甾体皂苷的分离与鉴定［J］.药学学报，2002，37（4）：267-270

［17］张黎明，袁毅.大孔吸附树脂富集穿龙薯蓣水溶性皂苷工艺研究［J］.天然产物研究与开发，2007，19：862-865

［18］张彩霞，佟少山，王育红，等.纤维素酶在穿山龙提取中的应用［J］.基层中药杂志，2000，14（2）：32

［19］王昌利，张振光，杨景亮，等.超声提高薯蓣皂苷得率的实验研究［J］.中成药，1994，16（4）：7