葛根素注射剂：治疗多种疾病，产率高含量纯

11.6.5　葛根素

葛根素（puerarin，结构为7，4′-二羟基异黄酮-8-βD-吡喃葡萄糖苷），主要存在于葛根中。葛根为豆科植物野葛（Pueraria lobata）或甘葛藤（P. thornsonii）的干燥根。葛根的主要有效成分为异黄酮类化合物，其中葛根素的含量最高。葛根素具有扩张冠脉和脑血管、改善心肌收缩功能、促进血液循环等作用，可降低心肌耗氧量，改善局部微循环障碍，降低血糖，还有提高视功能等作用。葛根素注射剂已应用于临床，用于治疗冠心病、心绞痛、高血压、心肌梗死、心率失常、高黏血症、β-高敏症、突发性耳聋和视网膜动脉静脉阻塞等疾病。

1.葛根素的化学结构

2.理化性质

（1）性状：葛根素为白色针状结晶（MeOH-HOAc），熔点203～205℃（187℃分解）。分子式C₂₁ H₂₀ O₉，相对分子质量416. 38，［α］²_D⁰＝＋18.14°（MeOH）。

（2）溶解性：葛根素可溶于热水、甲醇、乙醇等，难溶或不溶于乙酸乙酯、三氯甲烷、苯等。

3.葛根素的提取分离

葛根素常用乙醇、甲醇、水或稀乙醇回流或温浸提取，葛根素的纯化方法主要有大孔吸附树脂法、聚酰胺、氧化铝色谱法、盐析法、萃取法、活性炭脱色法等。重结晶溶剂为冰醋酸、甲醇-醋酸（1∶1）等。溶剂萃取法除需使用大量的有机溶剂外，且分离效果并不理想，大量使用有机溶剂会造成环境污染。大孔吸附树脂法分离效果较好，且吸附树脂可以反复使用，洗脱剂采用稀乙醇溶液，安全可靠，操作简便，成本低，环保，产品质量稳定，适于工业生产。

（1）葛根素的生产工艺-溶剂法

【工艺原理】

利用葛根素可溶于乙醇以及伴随杂质在乙醇中溶解度差的性质，通过反复溶解、浓缩、重结晶等达到纯化目的。

【操作过程及工艺条件】

1）提取：称取葛根粗粉150g，加4倍量乙醇，回流提取1小时，倾出上清液，药渣再回流提取一次。合并提取液，减压回收乙醇至原来体积的1/3，放置过夜，过滤除去沉淀物。将滤液回收乙醇至无醇味，挥干水，搅拌研细，烘烤，得葛根总黄酮提取物。

2）纯化：加入所得固体6倍量的无水乙醇，加热溶解，放冷，滤去沉淀。滤液回收乙醇至1/3量，于冰箱内放置过夜，次日过滤除糖。

3）结晶：向滤液加入等量冰醋酸，放置待结晶完全析出后，过滤，收集葛根素粗品。

4）混合溶剂结晶：在粗品中加3～5倍量无水乙醇，加热溶解，趁热过滤；将滤液回收溶剂至1/2～1/3量，加等量冰醋酸，放置析晶；过滤，用少量丙酮-冰醋酸（1∶1）混合溶剂洗涤结晶，干燥，得葛根素纯品。

【生产工艺流程】

（2）葛根素的生产工艺——酸水解法

【工艺原理】

葛根中主要异黄酮苷类化合物除葛根素外，还有4′-O-D-葡萄糖葛根素、6″-O-D-木糖葛根素、7-O-D-木糖葛根素、8-C-芹菜糖（1→6）葡萄糖大豆苷元、大豆苷、4′，7-二葡萄糖大豆苷元等；由于葛根素为碳苷化合物，在酸性条件下难以水解，而上述苷类化合物的水解产物主要为葛根素和大豆苷元。葛根素和大豆苷元可以通过乙酸乙酯和水萃取分离，葛根素进入水相，大豆苷元进入乙酸乙酯相。这样既有利于葛根素和大豆苷元的分离，又能够提高产率。

【操作过程及工艺条件】

1）总黄酮的提取：葛根干粉加入60%的乙醇冷浸12小时，在60℃下浸提2次，每次6小时，过滤，滤液减压浓缩得葛根总黄酮。

2）水解：将提取的葛根总黄酮加入5%盐酸溶液，加热回流4小时，水解，水解液趁热过滤。

3）萃取：待滤液冷却至室温，用乙酸乙酯萃取2次，萃取后的水相放置4天，析出葛根素粗品。

4）重结晶：将葛根素粗品用甲醇-醋酸混合物（1∶1）重结晶两次，得无色针状结晶。

【生产工艺流程】

【工艺注释】

1）二次提取液反复套用可以防止过多的多糖杂质浸出。

2）水解后的酸性溶液中，葛根素以盐的形式存在，通过过滤可以除去其他水不溶性杂质。(www.xing528.com)

3）该法具有操作简便、产品纯度和产率高、成本低的优点，容易实现产业化。

4）该工艺所得葛根素产品产率为1. 36%，含量可达98. 32%。

（3）葛根素的生产工艺——大孔吸附树脂法

吸附色谱法分离葛根素，吸附剂的选择是决定因素。氧化铝吸附量小，洗脱和再生困难；而聚酰胺的吸附量较好，但洗脱和再生也相对困难；大孔吸附树脂（如D-101和AB-8型）对葛根异黄酮选择性吸附能力强，不仅吸附量较好，而且洗脱和再生容易，性质稳定可反复使用，可用于工业化生产。葛根水提液通过大孔吸附树脂，葛根素被吸附，而大量水溶性杂质随水流出，解决了葛根素和其水溶性杂质不易分离的难题。下面介绍的大孔吸附树脂与酸水解法、活性炭脱色法、溶剂萃取法等联用，可达到较好的分离效果。

1）大孔吸附树脂-酸水解法

【工艺原理】

利用大孔吸附树脂对葛根异黄酮的吸附作用富集葛根总黄酮，通过酸水解将总黄酮水解为以葛根素和大豆苷元为主的产物，利用大孔吸附树脂对葛根素和大豆苷元的吸附作用的不同可将它们有效地分离。

【操作过程及工艺条件】

①提取：将制葛粉的废渣置于多功能提取罐中以6倍量70%乙醇提取2次，每次1小时，提取液过滤，浓缩至无醇味；②大孔树脂富集：浓缩液与制葛粉的废液合并，在一定压力下通过AB-8型大孔吸附树脂色谱柱动态吸附，吸附完全后用清水冲洗至无色，再用80%乙醇进行洗脱，洗脱液于多功能提取罐中回收乙醇，得葛根粗黄酮；③乙醇处理：乙醇溶解过滤，重复一次，合并滤液，浓缩至干；④水解：取葛根黄酮粗品浸膏，加5%盐酸加热回流水解5小时，趁热过滤，浓缩滤液至少量，放置过夜，析出葛根素粗品；⑤大孔树脂分离：将粗品上AB-8型大孔吸附树脂色谱柱，以30%、50%、80%乙醇梯度洗脱，TLC跟踪（展开剂体积比CHCl₃∶CH₃ OH∶H₂ O＝4∶1∶0. 05），收集的洗脱液浓缩至干，得白色粉末；⑥重结晶：再用甲醇-醋酸（体积比为1∶1）混合溶剂重结晶，得到无色针状葛根素结晶。

【生产工艺流程】

【工艺注释】

①本工艺综合利用葛根制葛粉的废渣和废液生产葛根总黄酮和葛根素；②两次采用大孔吸附树脂，第一次是用来富集制葛粉的废液和废渣提取液中的总黄酮，第二次是将水解液中葛根素与其他黄酮类成分分离，后者通过TLC跟踪收集含葛根素的洗脱液，确保产品的纯度。

2）大孔吸附树脂-活性炭法

【工艺原理】

利用葛根素可溶于热乙酸乙酯的性质，通过回流提取法和活性炭脱色达到纯化目的。

【操作过程及工艺条件】

①提取：葛根粗粉，用70%乙醇回流提取3次，静置后，抽滤，合并滤液，减压浓缩至1∶2；②柱色谱分离：浓缩液加盐酸调pH值至1～2，所得溶液过D-101型大孔吸附树脂柱，用水洗涤，再以pH1～2的50%乙醇洗脱，用TLC检查洗脱液，合并含有葛根素的洗脱液；③乙酸乙酯提取：洗脱液用氢氧化钠调pH5～6，浓缩，加硅藻土拌匀，干燥，研成粉末；粉末在连续回流提取器中用乙酸乙酯提取8小时；④活性炭脱色：上述所得乙酸乙酯溶液加2%活性炭，回流30分钟脱色，过滤，取滤液，回收部分溶剂，静置析晶，过滤得葛根素结晶。

【生产工艺流程】

【工艺注释】

①提取液在进行大孔吸附树脂分离前，调pH至1～2的目的是提高大孔吸附树脂的吸附作用；②含有葛根素的洗脱液拌入硅藻土，便于样品的分散，提高乙酸乙酯的提取效率。

3）大孔吸附树脂-溶剂萃取法

【工艺原理】

利用葛根素在正丁醇中的溶解性，通过萃取纯化葛根素。

【操作过程及工艺条件】

①提取：葛根粉碎过10目筛，用水煎煮提取，得葛根素粗提液，浓缩得粗提浸膏；②柱色谱分离：粗提物用水溶解后，滤去不溶物，上D-101型大孔吸附树脂柱，经吸附饱和后，用蒸馏水洗涤，至水清，水液弃去，改用70%乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩回收乙醇至无醇味；③萃取：上述洗脱液浓缩至相对密度d＝1. 2时加正丁醇萃取4次，合并正丁醇萃取液，回收溶剂至干；④重结晶：固体再用适当溶剂反复重结晶，烘干，得葛根素纯品。

【生产工艺流程】

【工艺注释】

①用水作提取溶剂的提取率虽然较醇类低，但差别不显著，其中甲醇提取率稍高，但由于甲醇有一定的毒性，操作条件要求较高，而乙醇和水的提取率差别不大，用水作提取溶剂，提取率在85%以上，基本上将大部分葛根素都提取出来；而且用水作提取溶剂安全无毒、操作方便，适合工业化生产。②取相对于粗提浸膏7倍量的大孔吸附树脂，用水洗涤除去糖类、蛋白质、鞣质等水溶性杂质，用12倍量的70%乙醇溶液作洗脱剂洗脱葛根素，葛根素的提取率可达90%以上。