3.2.4 色谱技术
1.大孔吸附树脂
大孔吸附树脂是利用化合物与大孔吸附树脂吸附力的不同及化合物相对分子质量大小的不同进行分离的方法。它不仅适用于离子型化合物如生物碱类、有机酸类、氨基酸类等的分离和纯化，而且也适用于非离子型化合物如黄酮类、萜类、苯丙素类、皂苷类等的分离和纯化。从分离机理上来讲，它既有物理吸附，又有半化学吸附（氢键吸附），还兼具有分子筛的作用（即排阻色谱）。近年来，大孔吸附树脂色谱被广泛应用于天然药物有效部位及化学成分的分离和纯化，有些已经应用到工业化生产中去，并取得了良好的效果。
（1）大孔吸附树脂的性质及分离原理：大孔吸附树脂是一类不含离子交换基团，具有大孔结构的高分子吸附剂。主要以苯乙烯、α-甲基苯乙烯、二乙烯苯、甲基丙烯酸甲酯、丙腈等为原料，在0.5%的明胶水混悬液中加入一定量致孔剂聚合而成，多为球状颗粒，直径一般在0.3～1.25mm之间。通常分为非极性、中极性、极性和强极性：①非极性大孔吸附树脂是由偶极距很小的单体聚合而得，不含任何功能基团，孔表的疏水性较强，可通过与小分子内的疏水部分的作用吸附溶液中的有机物，最适用于从极性溶剂（如水）中吸附非极性物质，如由二乙烯苯聚合而成的大孔吸附树脂Amberlite XAD-1～4（美国）、XAD-2、Daion HP-20、ADS-5（中国）等均属于这类树脂。②中极性大孔吸附树脂含有酯基，其表面兼有疏水和亲水部分，既可从极性溶剂中吸附非极性物质，也可以从非极性溶剂中吸附极性物质，如XAD-6～8（美国）、ADS-8（中国）。③极性大孔吸附树脂含有酰胺基、亚砜基、氰基、酚羟基等含N、O、S极性功能基，它们通过静电相互作用吸附极性物质，如XAD-9～10（美国）、ADS-16（中国）。④强极性大孔吸附树脂的结构中存在着吡啶基、氨基等极性很大的基团，如XAD-11～12（美国）、ADS-7（中国）。
理化性质稳定，不溶于酸、碱及有机溶剂，对有机物有浓缩、分离作用，且不受无机盐类及强离子、低分子化合物的干扰，在溶剂中可溶胀，室温下对稀酸、稀碱稳定。从显微结构上看，大孔吸附树脂含有许多具有微观小球的网状孔穴结构，颗粒的总表面积很大（大孔吸附树脂是依靠它和被吸附物质之间的范德华引力，通过它巨大的比表面进行物理吸附而工作），具有一定的极性基团，使大孔树脂具有较大的吸附能力；另一方面，这些网状孔穴的孔径有一定的范围，使得它们对通过孔径的化合物根据其相对分子质量的不同而具有一定的选择性。通过吸附性和分子筛原理，有机化合物根据吸附力的不同及相对分子质量的大小，在大孔吸附树脂上经一定的溶剂洗脱而达到分离的目的。
（2）大孔吸附树脂的吸附及解吸附的影响因素
1）被分离物极性大小的影响：大孔吸附树脂的吸附性能主要取决于吸附剂的表面性质，即树脂的极性（功能基）和空间结构（孔径、比表面积、孔容）。根据相似相吸附原理，非极性树脂易于吸附非极性化合物，极性树脂易于吸附极性物质，因此，选择树脂是否得当直接影响分离效果。通常树脂的极性和被分离物的极性既不能相似，也不能相差过大，极性相似会造成吸附力过强致使被吸附物不能被洗脱下来；极性相差过大，会造成树脂对被分离物吸附力太小，无法达到分离的目的。实际上，极性大小是一个相对的概念，要根据分子中极性基团与非极性基团的数目和大小来综合判断。对于未知化合物可通过一定的预实验和薄层色谱、纸色谱的色谱行为来判断，总之要进行综合分析。例如，皂苷类化合物是由非极性的三萜皂苷元和极性的糖基组成的，整个分子显示强极性，在水溶液中皂苷的苷元可通过疏水作用与树脂的疏水表面相吸附，其吸附行为类似于酚、胺类化合物，因此皂苷类既可以被非极性树脂吸附，也可以被中等极性的吸附。
2）被分离物相对分子质量的影响：一般来说，被吸附化合物的相对分子质量大小和极性的强弱直接影响到吸附效果。大孔吸附树脂具有多孔立体结构就是一种分子筛，可按相对分子质量的大小将物质分离。分子体积较大的化合物选择较大孔径的树脂，否则将影响分离效果。例如，银杏总黄酮的平均相对分子质量为760，其分子体积较大，使用孔径较大的树脂S-8（孔径为28～30nm）进行吸附，吸附量为126.7mg/g，而使用孔径较小的树脂D-4006（孔径为6.5～7.5nm）进行吸附时，吸附量为19mg/g。
3）溶剂的影响：溶剂对吸附力的影响主要有两个方面，一是对被分离物解离度的影响，二是对被分离物溶解度的影响。可以使被分离物解离度增加的溶剂或通过诱导可以使被分离物极性增大的溶剂均可降低树脂对被分离物的吸附力。被分离物在溶剂中的溶解度越大，树脂对它的吸附力越小。如有机酸盐、生物碱盐在水中的溶解度都很大，故大孔吸附树脂对它们的吸附力就较弱。对于非极性树脂，洗脱剂的极性越小，其洗脱力就越大。对于中等极性的树脂和极性较大的化合物，常用极性较大的溶剂如水、含水醇、甲醇、乙醇、丙酮等洗脱。一般先用水洗脱，再用浓度逐渐增高的乙醇或甲醇洗脱。多糖、蛋白质、鞣质等水溶性杂质会随着水流下，极性小的物质后下。对于有些具有酸碱性的物质还可以用不同浓度的酸、碱液结合有机溶剂进行洗脱。
4）pH值的影响：天然药物中的许多成分具有一定的酸碱性，在pH值不同的溶液中溶解性不同，在应用大孔吸附树脂处理这一类成分时pH值的影响显得至关重要。对于碱性物质一般在碱液中吸附，在酸液中解吸附；酸性物质一般在酸液中吸附，在碱液中解吸附。中性化合物虽然在酸性、碱性溶液中均不解离，酸碱性对分子的极性影响小，但最好还是在中性溶液中进行，以防止酸碱性对化合物结构造成破坏。
5）温度的影响：大孔吸附树脂的吸附作用主要是由于它具有巨大的表面积，是一种物理吸附，低温不利于吸附，但在吸附过程中又会放出一定的热量，所以操作温度对其吸附也有一定的影响。
6）原液浓度的影响：原液浓度也是影响吸附的重要因素，如果原液浓度过低，则提纯时间增加，效率降低；而如果原液浓度过高则泄漏早，处理量小，树脂的再生周期短。
7）其他影响因素：药液在上柱之前一般要经过预处理，预处理不好则会使大孔吸附树脂吸附的杂质过多，从而降低其对有效成分的吸附。洗脱液的流速、树脂的粒径、树脂柱的高度也会产生一定的影响，通常较高的洗脱液流速、较小的树脂粒径和较低的树脂高度有利于增大吸附速度，但同时也使单柱的吸附量有所降低。玻璃柱的粗细也会影响分离效果，若柱子太细，则在洗脱时树脂易结块，壁上易产生气泡，流速会逐渐降为零。
（3）大孔吸附树脂的特点
1）优点：大孔吸附树脂之所以能得到广泛应用，主要是它能解决其他常用吸附剂难以解决的问题：①具有吸附容量大、吸附速度快、易解吸、易再生的优点；②物理与化学稳定性高，不溶于酸、碱及有机溶剂；③对有机物选择性好，不受无机盐类及其他强离子、低分子存在的影响，且反而有利于吸附；④品种多，不同品种可吸附多种有机化合物；⑤流体阻力较小；⑥脱色能力强等优点。
2）缺点：由于大孔吸附树脂应用时间较短，其应用和性能研究中尚存在一些不足：①国产大孔吸附树脂吸附剂质量存在着刚性不强、易破碎，以及致孔剂等合成原料或溶剂去除不净有残留，易流入药液造成二次污染；②大孔吸附树脂在生产应用中缺乏规范化的技术要求，对其预处理、再生纯化工艺条件缺乏规范化评价指标。因此，制定大孔吸附树脂的质量标准及其在天然药物分离纯化中应用的技术规范，使大孔吸附树脂的生产应用达到标准化和规范化，将有利于提高天然药物产品质量和推动传统剂型的改革，提高整个制药行业的水平，促进制药行业的高技术产业化、现代化。
（4）大孔吸附树脂的使用及注意事项
1）贮存运输：①应贮存在密封容器内，避免受冷或曝晒；②贮存温度：4～40℃之间；③树脂贮存期为2年，超过2年复检合格方可使用。若发现树脂失水，不能直接向树脂中加水，应先加入适量浓食盐水，使树脂恢复湿润。
2）预处理：预处理的目的是为了防止树脂中含有残留的未聚合单体、致孔剂、分散剂和防腐剂对人体造成危害，保证用药安全。故大孔吸附树脂在使用前要进行预处理。
预处理的方法：乙醇浸泡24小时→用乙醇洗至流出液与水1∶1混合后不浑浊→用水洗至无醇味，备用。
3）上样：将样品溶于少量水中，以一定的流速加到柱的上端进行吸附。上样液以澄清为好，上样前要配合一定的处理工作，如上样液的预先沉淀、滤过处理、调节pH值，使部分杂质在处理过程中除去，以免堵塞树脂床或在洗脱中混入成品。
4）洗脱：先用水清洗以除去树脂表面或内部还残留的水溶性大的强极性杂质（如多糖或无机盐），然后用所选洗脱剂在一定的温度下以一定的流速进行洗脱。
5）再生：再生的目的是除去树脂上残留的强吸附性杂质，以免影响下一次使用过程中树脂对被分离成分的吸附，再生后树脂可反复进行使用。
再生的方法：乙醇洗脱至无色→5% HCl水溶液浸泡2～4小时→水洗至中性→2% NaOH溶液浸泡2～4小时→水洗至中性，备用。
（5）大孔吸附树脂的应用
大孔吸附树脂广泛应用于天然药物中有效成分如皂苷、黄酮、内酯、生物碱等化合物的分离和纯化。对人参皂苷、三七皂苷、绞股蓝皂苷、薯蓣皂苷、甘草皂苷、黄芪皂苷、橙皮苷、银杏黄酮内酯、山楂总黄酮、淫羊藿黄酮、大豆异黄酮、茶多酚、红豆杉生物碱、多种天然色素等的分离纯化都有良好的效果。
1）黄酮（苷）类：具有代表性的是银杏叶提取物，应用大孔吸附树脂分离银杏叶提取物，既达到其质量标准，又降低了成本。比较ADS-17、ADS-21、ADS-F8等不同型号的大孔吸附树脂，其中ADS-17对黄酮类化合物具有很好的选择性，可得到黄酮苷含量较高的银杏叶提取物。选择6种大孔吸附树脂，比较对竹叶黄酮的吸附性能及吸附动力学过程，发现AB-8树脂适于竹叶黄酮的纯化，经AB-8树脂吸附分离后，提取物中黄酮含量提高1倍以上。
2）皂苷和其他苷类：大孔吸附树脂在苷类的分离纯化工艺中应用很多。对D101型大孔吸附树脂富集人参总皂苷的吸附性能与洗脱参数进行了研究，结果表明依次以水、10%和50%乙醇洗脱，人参总皂苷洗脱率在90%以上，干燥后总固形物中人参总皂苷纯度达60.1%。通过对7种吸附树脂进行筛选实验，对树脂孔径和比表面积的比较发现，AASI-2树脂对绞股蓝皂苷的吸附量大、速度快，且易于洗脱，回收率高。研究考察大孔吸附树脂提纯刺五加中刺五加苷最好的提取方法是以水为溶剂，常温超声波提取，浓缩后，用HPLC检测刺五加苷含量，按照刺五加苷与干树脂质量比为1∶0.021的量向浓缩液中加入树脂，缓慢搅拌吸附1小时，吸附平衡时间约1小时，离心，滤出树脂，装柱，用体积分数为20%的乙醇-二氯甲烷混合溶剂洗脱，收集洗脱液，再经冷冻干燥处理，得刺五加苷。
3）生物碱类：采用大孔吸附树脂对黄连药材及其制剂中的小檗碱进行富集，研究表明含0.5%硫酸的50%甲醇解吸能力好，平均回收率达100.03%，符合药材及其制剂中有效成分定量分析要求，故大孔吸附树脂可用于黄连药材及其制剂中小檗碱的富集及除杂。考察了7种大孔吸附树脂发现AB-8吸附及解吸效果较好，是一种较适宜的吸附剂，并对其工艺进行考察，结果27℃、1mol/L盐离子浓度、pH8的水相为最佳上样条件，洗脱剂为pH3的三氯甲烷-乙醇（1∶1）混合溶剂。应用DF01型树脂能直接从苦豆籽浸取液中吸附分离生物碱，在室温、吸附液pH为10，NaCl浓度为1.0mol/L，吸附流速为5BV/h条件下，对总生物碱的吸附量可达到17mg/m l以上。在室温、2.5BV/h的解吸流速下，以pH为3，乙醇-水（80∶20）为解吸液，可使解吸率达到96%以上。
4）其他：采用明胶沉淀法、调pH值法、聚酰胺法以及大孔吸附树脂法对大黄提取液中总蒽醌进行纯化，研究表明4种纯化方法所得纯化液的固体量明显降低，而对总蒽醌的保留率存在显著的差异，以两种大孔吸附树脂法的保留率最高（93.21%、95.63%）。选用NKA-9树脂从杜仲叶提取物中分离富集绿原酸，研究表明NKA-9树脂对提取液中绿原酸的最佳分离条件为：当样品液浓度低于0.3mg/m l、pH3、流速2mg/m l时，用50%乙醇洗脱，得到粗产品纯度为25.12%，收率为78.5%。将川芎醇提物减压浓缩后，上大孔吸附树脂柱，先用水洗至还原糖反应呈阴性，再用30%乙醇洗脱，收集30%乙醇洗脱液，减压浓缩得川芎总提物，其中川芎嗪和阿魏酸的含量约占本品的25%和29%。
2.聚酰胺色谱
聚酰胺（polyamide）系由酰胺聚合而成的一类高分子物质。聚酰胺中除含有极性的酰胺基团外，还含有非极性的脂肪链，故既可用于分离水溶性成分，又可用于分离脂溶性成分。可用于分离黄酮类、醌类、酚酸类、木脂素类、生物碱类、萜类、甾体类、糖类以及氨基酸类等各种极性、非极性化合物。既有氢键吸附（半化学吸附）色谱的性质，又有分配色谱的性质，属于双重色谱吸附剂。
（1）聚酰胺吸附原理及吸附力与结构的关系
1）氢键吸附：①吸附原理：在聚酰胺分子中有许多酰胺基—CONH—，其羰基可与羧基、酚羟基等形成分子间氢键，胺基可与化合物中的羰基等形成分子间氢键，因而对这些物质具有吸附作用。化合物不同，与聚酰胺中的酰胺基形成分子间氢键的能力就不同，聚酰胺对它的吸附力也就不同，故可利用该类化合物的这一性质用聚酰胺色谱方法将它们分离，这就是所谓的“氢键吸附”学说。②被吸附物质结构与吸附力的关系：被吸附物质与聚酰胺形成分子间氢键的能力与被吸附物质中含有能形成分子间氢键官能团的数目及位置（能形成分子间氢键的官能团越多，聚酰胺对其吸附力就越强）、官能团形成分子间氢键能力的大小、是否可形成分子内氢键（能形成分子内氢键者，吸附力下降）、被吸附物质的芳香性大小及共轭系统的长短（芳香性越强或共轭链越长，聚酰胺对它的吸附力就越强）、被吸附物质的水溶性大小等有关。③洗脱溶剂与洗脱力的关系：被吸附物质是否易被洗脱下来与洗脱剂对被吸附物质的溶解度以及吸附剂与洗脱剂共同争夺被吸附物质的能力等有关。醇羟基、水与聚酰胺形成氢键能力十分弱，尤其是水分子与聚酰胺形成氢键能力最弱，故聚酰胺与被分离物质形成氢键能力在水溶液中最强。在聚酰胺柱色谱分离时，通常用水装柱，试样也尽可能制成水溶液上柱，有利于聚酰胺对溶质的充分吸附。然后用不同浓度的含水醇洗脱，并不断提高醇的浓度，逐步增强从柱上洗脱物质的能力。甲酰胺、二甲基甲酰胺、尿素水溶液因分子中均有酰胺键，可以同时与聚酰胺及酚类等化合物形成氢键缔合，故有很强的洗脱能力。此外，碱、酸水溶液均能破坏聚酰胺与溶质之间的氢键缔合，也有很强的洗脱能力，可用于聚酰胺的再生处理。洗脱剂的顺序依次为：水→稀乙醇（30%～50%）→浓乙醇（70%～90%）→无水乙醇→丙酮→氢氧化钠水溶液→甲酰胺→二甲基甲酰胺→尿素水溶液。
2）分配色谱：聚酰胺“双重色谱”性能学说可以解释那些难以与聚酰胺形成分子间氢键或形成氢键能力不太强的化合物，如萜类、甾体、生物碱、强心苷等类化合物很难与聚酰胺形成分子间氢键，但它们也可以用聚酰胺色谱分离。在聚酰胺分子中既有非极性的脂肪链，又有极性的酰胺基团，而且酰胺基还可通过氢键吸附大量的水分子。聚酰胺的双重色谱：①当用极性洗脱剂（如水、含水乙醇系统等）洗脱时，聚酰胺中的非极性脂肪链可作为非极性固定相，其色谱行为类似于反相分配色谱；②当用极性较小的溶剂（如乙酸乙酯、乙酸乙酯-甲醇、三氯甲烷、三氯甲烷-甲醇、三氯甲烷-丙酮等）进行洗脱时，聚酰胺中的酰胺基以及酰胺基吸附的水分子可作为极性固定相，其色谱行为类似于正相分配色谱行为。
（2）聚酰胺柱色谱的一般操作
1）预处理：聚酰胺中通常含有两类杂质，一种是锦纶的聚合原料单体（己内酰胺）以及小分子聚合物，另一种是由锦纶带来的蜡质（锦纶丝在制成后，表面涂过一层蜡）。这些杂质能与酚类等化合物形成复合物，蜡质能被有机溶剂洗脱下来，导致污染被分离的化合物。去除方法：①除去聚合原料单体及小分子聚合物可用二甲基甲酰胺（dimethyl formamide，DM F）或二甲基甲酰胺-醋酸-水-乙醇（5∶10∶30∶20）的混合溶液进行洗涤。②除去蜡状物质可用甲醇-二氯乙烷（1∶1）的混合溶液进行洗涤。③采用同时去除的方法，具体操作方法：取聚酰胺颗粒，加入90%～95%乙醇溶液浸泡，不断搅拌，除去气泡后湿法装入色谱柱中；用3～4倍量的90%～95%乙醇溶液洗涤，洗至洗液澄明并蒸干后不留残渣或残渣量极少为止；再用2～3倍量的5% NaOH水溶液、1倍量的蒸馏水、2～3倍量的10%醋酸水溶液依次洗涤；最后用水洗至中性即可使用。
2）装柱：除去细粉的聚酰胺用乙醇浸泡脱除聚酰胺中的小分子聚合物和蜡状物质：①如果待分离的是酚类等化合物，所用的洗脱剂多为水和含水乙醇，则通常以水为溶剂装柱；②如果所要分离的是萜类、皂苷类、甾体类、生物碱类等化合物时，所用的洗脱剂是极性较小的有机溶剂，装柱所用的溶剂则要用柱色谱的起始洗脱剂。因预处理时的最后溶剂是水，故不能用极性较小的有机溶剂直接更替水溶液，应该先用乙醇将色谱柱中的水洗去；再用一个中等极性的溶剂如乙酸乙酯等将乙醇洗去；最后再用装柱所用溶剂将乙酸乙酯洗去。因为在聚酰胺处理过程中，聚酰胺颗粒内部已充满水或其他溶剂，故在用各类溶剂洗脱更替水或乙酸乙酯等溶剂时，要经过一个充分的浸泡时间，以便让聚酰胺颗粒内部的溶剂能充分地被更替掉。如果所用的装柱溶剂是比重较大的三氯甲烷或二氯甲烷，会使聚酰胺颗粒漂浮在溶剂上，因此注意处理方法：①加入溶剂和聚酰胺颗粒；②逐渐将柱上端多余的溶剂放出；③在柱上端放一个扎有许多小孔的滤纸；④再在滤纸片上加一些玻璃小球。
3）加样：①聚酰胺的载样量较大，通常每100m l聚酰胺颗粒可上1.5～2.5g样品。具体上样方法，与硅胶、氧化铝、活性炭等大体相同，可参考有关内容。上样后需在色谱柱的上端加适量的空白聚酰胺、滤纸以及玻璃球等。②样品常用起始洗脱剂溶解，其浓度通常为20%～30%。如果样品在起始洗脱剂中不溶解，可用甲醇、乙醇、丙酮、乙醚等易挥发的有机溶剂溶解，加入聚酰胺颗粒适量，拌匀后将溶剂减压蒸去，然后用洗脱剂浸泡装入柱中。③如果是利用聚酰胺柱色谱除去天然药物中的鞣质，样品上柱量则可大大增加。通常可通过观察鞣质在色谱柱上形成橙红色色带的移动情况来确定加入样品量，当样品加至橙红色色带移至柱的近底端时停止加样。
4）洗脱：聚酰胺色谱柱用的洗脱剂分为氢键吸附色谱用洗脱剂和分配色谱用洗脱剂。①当主要为氢键吸附色谱时，常用的洗脱剂是水和不同浓度的乙醇水溶液，先用水洗脱，然后依次用不同浓度的乙醇进行洗脱（乙醇的浓度由低到高，如10%、20%、30%、50%、70%、95%等），如仍有物质未被洗脱下来，则可采用35%的氨水洗脱；②当主要为分配色谱时，常用的洗脱剂与硅胶、氧化铝柱色谱大体相同，即均为常用的有机溶剂；③一般根据洗脱液的颜色或蒸干后的残留物确定是否更换洗脱剂，当洗脱液的颜色很淡或蒸干后留有的残渣很少时可更换下一种溶剂；④以适当体积分瓶收集（通常是每一个柱保留体积为一份，如果样品较易分离，则可适当增加每份的体积）；⑤减压浓缩（在以水或含水醇为洗脱剂时，因为这些溶剂的沸点较高）以防止在较高温度下长时间加热，引起某些成分发生化学变化；⑥分别进行薄层检查（最好使用聚酰胺薄膜），相同者合并。
5）再生：反复使用后的聚酰胺：①一般用5% NaOH的水溶液洗涤，即可把被吸附的物质洗脱除去；②有时因鞣质等多元酚类与聚酰胺有不可逆吸附，用氢氧化钠水溶液很难洗脱，此时可用5% NaOH的水溶液浸泡，每天更换一次，一周后，鞣质即可基本被除去；③然后用蒸馏水洗至pH8～9，再用2倍量的10%醋酸洗涤，最后用蒸馏水洗至中性即可。
（3）聚酰胺柱色谱的特点
1）优点：聚酰胺具有稳定的物理化学性质，吸附选择性独特，应用广泛，操作方便，重复使用周期长，节省费用，且不产生二次污染等特点，是一种环境友好的分离树脂，在制药工业等领域有很大的优势，应用前景广阔。
2）缺点：①冲洗速度慢，克服办法为预先筛去细粉、与硅藻土（1∶2）混合物装柱或加压或减压冲洗等；②含甲醇的溶剂可洗脱低相对分子质量的聚酰胺，克服办法为采用50%甲醇水溶液预先洗涤。
（4）聚酰胺柱色谱的应用
1）染料木素和染料木素-4′-葡萄糖苷的分离：①取槐角（Sophora japonica）2kg，用乙醇回流提取3次，回收溶剂；②提取物用酸水解，放置，析出沉淀物，过滤；③沉淀物依次用乙醚和甲醇提取；④取甲醇提取物28g，用甲醇溶解，加入聚酰胺颗粒60g，拌匀，减压抽干磨细，备用；⑤取一根内径为5.3cm、长为80cm的玻璃柱，以水为溶剂，湿法装柱，然后将拌有样品的聚酰胺颗粒装入聚酰胺色谱柱柱顶；⑥依次用水、30%乙醇水溶液、50%乙醇水溶液洗脱，每份300m l，分步收集，减压回收溶剂，用聚酰胺薄膜检查，相同者合并，每种溶剂洗至有很少物质残留时更换下一种溶剂；⑦在30%乙醇水溶液洗脱的流分中析出白色晶体，该晶体用二甲基甲酰胺重结晶获得染料木素-4′-葡萄糖苷晶体（genistein-4′-glucoside，sophoricoside，熔点为257℃）；⑧在50%乙醇水溶液洗脱的流分中析出黄色晶体，用甲醇-水混合溶剂重结晶获得染料木素晶体（genistein，熔点为294～296℃）。
2）补骨脂中黄酮的分离：①将补骨脂（Psoralea cory lifolia）的种子磨碎，用苯加热回流提取3次，合并提取液；②用5%碳酸钠水溶液振摇提取3～4次，使黄酮类化合物成盐转溶于碱液中，合并提取液；③加盐酸酸化，用三氯甲烷提取3～4次，合并提取液并浓缩至小体积即析出黄色固体；④黄色固体经干燥后用少量乙醚溶解，加入适量聚酰胺颗粒，拌匀，挥发除去乙醚；⑤将拌有聚酰胺颗粒的黄色固体加于聚酰胺色谱柱的上端，先用水洗脱，然后用50%甲醇水溶液、70%甲醇水溶液依次洗脱；⑥取50%甲醇水溶液的洗脱液，回收溶剂，浓缩，得到白色针状晶体补骨脂甲素（熔点为212℃）；⑦取70%甲醇水溶液的洗脱液，回收溶剂，得到黄色针状晶体补骨脂乙素（熔点为165℃）。
3.凝胶色谱
凝胶色谱是指待分离物质随流动相经过固定相时，待分离物质中的各组分按相对分子质量大小不同被分离的一种液相色谱方法。固定相凝胶是一种不带电荷的具有三维空间的多孔网状结构的物质，即凝胶颗粒的细微结构如同一个筛子，小的分子可以进入凝胶网孔，大的分子则被排阻于凝胶颗粒之外，因而具有分子筛的性质，故又称为分子筛过滤（molecular sieve filtration）色谱。因整个色谱过程中一般不更换洗脱剂，好像过滤一样，故又可将其称为凝胶过滤（gel filtration）色谱。在天然药物化学研究中，凝胶色谱主要用于蛋白质、酶、多肽、氨基酸、多糖、苷类、甾体以及部分黄酮、生物碱的分离。
（1）凝胶的性质及类型：凝胶的种类很多，不同种类凝胶的性质和应用范围有所不同，常用的有葡聚糖凝胶（Sephadex G）和羟丙基葡聚糖凝胶（Sephadex LH-20）。
1）葡聚糖凝胶：葡聚糖凝胶是由葡聚糖和甘油基通过醚键相互交联形成的三维空间网状结构的大分子物质。由于其分子内含有大量羟基而具亲水性，在水中溶胀，故Sephadex G系列的凝胶只适合在水中应用，不同型号的凝胶适合分离不同相对分子质量物质。凝胶颗粒的网孔大小可以通过调节葡聚糖和交联剂的比例及反应条件来控制，交联度越大，网孔结构越紧密，孔隙越小，吸水膨胀就越少；反之，交联度越小，网孔结构越疏松，孔隙越大，吸水膨胀就越大。商品型号即按凝胶的交联度大小分类，并以吸水量来表示：英文字母G代表葡聚糖凝胶，后面的阿拉伯数字表示该凝胶的10倍吸水量，如Sephadex G-25的吸水量为2.5m l/g。
2）羟丙基葡聚糖凝胶：羟丙基葡聚糖凝胶是在Sephadex G-25分子中的羟基上引入羟丙基而成醚键结合的多孔性网状结构物质。虽然Sephadex LH-20分子中羟基总数未改变，但非极性烃基部分所占比例相对增加，因此这种凝胶既有亲水性又有亲脂性，不仅可在水中应用，也可在多种有机溶剂中溶胀后使用。如三氯甲烷、丁醇、四氢呋喃、二氧六环等，但是甲苯、乙酸乙酯中溶胀的不多，其溶胀的性质与原凝胶的交联度、羟基的取代程度、溶剂的性质等有关。Sephadex LH-20的使用方法与葡聚糖凝胶类似：①用低级醇为溶剂时，芳香族、杂环化合物在凝胶上有阻滞作用；②用三氯甲烷为溶剂时，芳香族、杂环化合物不受阻滞；而对含羟基和含羰基的化合物有阻滞作用。
3）其他：在葡聚糖凝胶分子上引入各种离子基团，使凝胶具有离子交换剂的性能，同时保留凝胶的特点。如羧甲基交联葡聚糖凝胶（CM-Sephadex）、二乙氨基乙基交联葡聚糖凝胶（DEAE-Sephadex）、磺丙基交联葡聚糖凝胶（SP-Sephadex）、苯胺乙基交联葡聚糖凝胶（QAESephadex）。此外，商品凝胶还有聚丙烯酰胺凝胶（sephacrylose，商品名：Bio-GelP）、琼脂糖凝胶（sepharose，商品名：Bio-GelA）。
（2）凝胶色谱的分离原理：凝胶的分离原理随凝胶种类的差异而不同，包括分子筛作用、离子交换作用和氢键作用等，其中，最主要的是分子筛作用。当待分离物质加入色谱柱后，待分离物质会随洗脱液的流动而移动，因不同体积分子的移动速度不同，体积大的物质沿凝胶颗粒间的空隙随洗脱液移动，阻滞作用小，流程短，移动速度快，先被洗出色谱柱；体积小的物质能够进入凝胶颗粒的网孔内部，然后再随洗脱液扩散出来，阻滞作用大，所以其流程长，移动速度慢，后被洗脱出柱，即体积大的先出柱，体积小的后出柱。当两种以上不同体积的物质均能进入凝胶颗粒内部时，由于它们被排阻和扩散的程度不同，在色谱柱内所经过的时间和路程也就不同，所以可以得到分离。
（3）凝胶色谱的一般操作
1）凝胶的选择：根据待分离物质相对分子质量的大小选择不同型号的凝胶，如分离蛋白质采用100～200号筛目的Sephadex G-200效果好，脱盐用Sephadex G-25、G-50，用粗粒、短柱，流速快。凝胶粒度也能影响分离效果，通常凝胶的粒度越细，分离效果越好，但流速慢，因此要根据实际情况选择合适的粒度和合适的流速。如分离相对分子质量相差悬殊的物质时，使用较粗的颗粒如100～150目，采用慢速洗脱，即可达到要求。
2）预处理：商品凝胶通常为干燥的颗粒，在装柱前，凝胶必须经过充分溶胀（为了加快溶胀，缩短溶胀时间，可在水浴上进行），否则由于凝胶继续溶胀，会逐渐降低流速，影响色谱柱的均一性，甚至会造成色谱柱的胀裂。根据所需凝胶体积估计干胶的量，一般葡聚糖凝胶吸水后的凝胶体积约为其吸水量的2倍，例如Sephadex G-200的吸水量为20，1g的Sephadex G-200吸水后形成的凝胶体积约为40m l。
3）装柱：色谱柱的直径大小不影响分离度，样品用量大，可加大柱的直径；分离度取决于柱高。粗分时可选用较短的色谱柱，如果要提高分离效果则可适当增加柱的长度，但柱太长会大大降低流速，分级分离时柱高与直径之比为（20～100）∶1。装柱操作：①先安装色谱柱呈竖直位置，在柱顶部连接一个长颈漏斗（长约100cm，直径约为柱径的一半），并在漏斗中安装搅拌器；②在色谱柱和漏斗中加满水或洗脱剂，在搅拌下缓缓加入凝胶悬浮液，色谱柱出口的流速维持在5～10m l/m in；③凝胶颗粒沉积色谱柱底后关闭色谱柱，使其自然沉降达1～2cm时再打开色谱柱，直至所需高度为止；④拆除漏斗，用滤纸片盖住凝胶柱床表面；⑤用大量的水或洗脱液洗涤，备用。
4）上样：具体的加样量与凝胶的吸水量有关，吸水量越大，可加入样品的量就越大。如对于高吸水量的凝胶（如Sephadex G-200），可加样品量为总床体积的0.3～0.5mg/m l，样品溶液的体积则为总床体积的2%为宜；对于吸水量较低的凝胶（如Sephadex G-75），可加样品量为总床体积的0.2mg/m l，样品溶液的体积则为总床体积的1%为宜。上样操作：①装好的色谱柱至少要用相当于3倍量床体积的洗脱液平衡，待平衡液流至床表面以下1～2mm时，关闭出口；②用滴管吸取样品溶液，在床表面上约1m l高度，沿色谱柱柱壁圆周缓缓加入样品溶液；③加完样品溶液后打开出口，使样品完全渗入色谱床，再关闭出口；④用少量洗脱液将管壁残留的样品洗下，再打开出口，使渗入柱内，再关闭出口；⑤在柱床上面覆以薄层脱脂棉，以保护柱床表面；⑥加入洗脱液进行洗脱。
5）洗脱：对于水溶性物质的洗脱，常以水或不同离子强度的酸、碱、盐的水溶液或缓冲溶液作为洗脱剂，洗脱剂的pH与被分离物质的酸碱性有关。洗脱规律：①通常在酸性洗脱剂中碱性物质容易洗脱，在碱性洗脱剂中酸性物质容易洗脱；②多糖类物质以水溶液洗脱最佳；③有时为了增加样品的溶解度，可使用含盐的洗脱剂，在洗脱剂中加入盐类的另一个作用是盐类可以抑制交联葡聚糖和琼脂糖凝胶的吸附性质；④对于水溶性较小或水不溶的物质可选用有机溶剂作为洗脱剂；⑤对于阻滞较强的成分，也可使用水与有机溶剂的混合洗脱剂，如水-甲醇、水-乙醇、水-丙酮等；⑥芳香类化合物在高交联度的凝胶上有阻滞作用，这种阻滞作用与洗脱剂有关，即有些洗脱剂可降低或消除这种阻滞作用。例如用Sephadex G-25测定肽的相对分子质量时，以苯酚-醋酸-水（1∶1∶1）为洗脱剂时，含芳香基团的肽不被阻滞。
6）收集和检出：凝胶色谱的流速较慢，每份的体积较小，收集的流分较多，最好能与分步收集器相连。如果样品为蛋白质、核苷酸或多肽类，可采用紫外检测器进行检测，各自的检测波长分别是280nm、260nm和230nm。
7）凝胶的再生：凝胶色谱的载体不会与被分离物发生任何作用，因此使用过的凝胶无需特殊处理：①常规：只要在色谱柱用完之后，用缓冲溶液处理，稍加平衡即可进行下一次色谱；②有微量污染时：可用0.8%氢氧化钠（含0.5mol/L氯化钠）溶液处理；③再生：用50℃左右的2%氢氧化钠和0.5mol/L氯化钠的混合液浸泡后，再用水洗净即可。
8）凝胶柱的保养：葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶都是糖类物质，极易染菌。常用方法是在凝胶中加入一些抑菌剂，如叠氮钠（0.02%）、三氯丁醇（0.01%～0.02%）、乙基汞代巯基水杨酸钠（0.005%～0.01%）、苯基汞代盐（0.001%～0.01%）等。长期不用时，最好以干燥状态保存，储存之前要进行净化处理：①用水洗净；②用含乙醇的水洗，逐渐加大乙醇用量；③最后用95%的乙醇洗，可全部去水；④再用乙烯去除乙醇；⑤抽干后于60～80℃干燥保存。
（4）凝胶色谱的应用
1）天花粉蛋白的凝胶色谱分离：天花粉系植物栝楼块茎，其中除含有能使核糖体失活的毒蛋白外，还含有天花粉凝集素等蛋白质。其分离过程如下：Sephadex G-50柱（1.8cm×100cm），用50mmol/L Tris-HCl、pH7.8缓冲液平衡，一定量的天花粉硫酸铵糊（90%饱和度的沉淀）溶于2m l缓冲平衡液中，除去不溶物，上样洗脱，流速为1m l/min，每一流分体积为5m l。在外水体积前后出现一个蛋白质峰Ⅰ，接着的蛋白质峰Ⅱ即为天花粉毒蛋白。所得蛋白质经SDS-PAGE电泳和圆盘电泳鉴定都是单一条带。
2）西洋参多糖的分离纯化：西洋参（Panax quiquefolium）系五加科人参属多年生草本植物，其中的西洋参多糖具有较好的抑制S180肉瘤生长的作用。采用体外细胞因子刺激活性的指标跟踪有效成分指导提取分离，经分离纯化得到4个西洋参活性多糖PPQ I-1～4。操作流程：①取西洋参根茎粗粉，经水提取乙醇沉淀；②沉淀用乙醇、丙酮、乙醚依次洗脱，得到西洋参粗多糖；③经Sevage法洗脱蛋白；④唾液淀粉酶除淀粉；⑤用Sephadex DEAE-A50凝聚色谱柱进行分离，以0～0.8m l/L NH4 HCO3溶液梯度洗脱得到西洋参多糖PPQ；⑥经Sephadex G-200纯化，以0.1m l/L磷酸盐缓冲液洗脱，得到4个西洋参活性多糖PPQ I-1～4；⑦经聚丙烯酰胺凝聚电泳检测4个多糖均为纯多糖。
4.离子交换色谱
离子交换色谱（ion exchange chromatography，IEC）是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时结合力大小的差别而进行分离的一种色谱方法。目前，离子交换色谱法大部分采用合成离子交换剂，一种是单体在聚合前本身就含有交换离子，另一种是首先形成聚合物，然后引进交换基团。另外，也有在纤维素或多聚糖上人工引入交换基团所成的离子交换剂，大多用于天然药物大分子蛋白质、多肽、多糖的分离纯化。因此，离子交换色谱被分为离子交换树脂、离子交换纤维素和离子交换凝胶三种。利用离子交换树脂对各种离子的亲和力不同，从而使能离子化的化合物得到分离的方法称为离子交换树脂色谱法，用途最广。
（1）离子交换色谱的分离原理：离子交换色谱的固定相是离子交换剂，它是一种不溶于水的惰性球状固体，表面积大，能吸收大量的水。在离子交换剂的分子中含有可离解的酸性基团或碱性基团，这些可离解基团在水溶液中能离解出本身的离子，并与溶液中的其他阳离子或阴离子交换。这种交换反应是可逆的，并遵守化学平衡定律。虽然离子交换反应是可逆的，但在色谱柱上进行分离时，因连续不断地添加新的交换溶液，使交换反应的平衡不断向正方向进行，直到交换完全，故将交换剂上的离子全部洗脱下来。当一定量的溶液通过离子交换剂时，由于溶液中的离子会不断地被交换到色谱柱上，其浓度会不断下降，所以溶液中的物质也可以完全被交换到色谱柱上。根据这一原理，可以将天然药物的提取物通过离子交换剂，将酸性成分或碱性成分或酸碱两性成分交换到色谱柱上，然后再用适当的溶剂将其洗脱下来，从而达到与其他成分分离的目的。
如果有两种以上的成分被交换到离子交换剂上，当用另一种洗脱液进行洗脱时，其洗脱能力与各成分洗脱反应的平衡常数有关，化合物的结构不同，其洗脱反应的平衡常数就有可能不同，从色谱柱上被洗脱的难易程度就不同，故可以利用离子交换树脂色谱使具有不同化学结构的化合物得到分离。
蛋白质、多肽的两性特征使其可以根据pH不同而呈阳离子或阴离子状态存在。其等电点决定了所用流动相的pH和所用离子交换剂的类型。蛋白质、多肽与离子交换剂之间的结合强度取决于蛋白质和多肽结构上共同发挥作用的离子交换基团数目、离子交换剂上的电荷密度以及流动相的离子强度等。因此，蛋白质和多肽的洗脱可用离子强度递增的方式进行，也可用pH梯度洗脱方式进行或两者联合使用。
（2）离子交换剂的种类：离子交换剂指含有解离性离子交换基团的高分子物质，由两部分组成：一部分是大分子聚合物基质主体结构，另一部分是具有电荷活性的功能基团。离子交换剂的大分子聚合物基质可以由多种材料制成，聚苯乙烯离子交换剂（又称聚苯乙烯树脂）是以苯乙烯和二乙烯苯合成的具有多孔网状结构的聚苯乙烯基质。聚苯乙烯离子交换剂机械强度大、流速快，但与水的亲和力较小，具有较强的疏水性，容易引起蛋白质的变性，故一般常用于小分子物质的分离，如有机酸、生物碱、氨基酸等。以纤维素、球状纤维素、葡聚糖、琼脂糖为基质的离子交换剂都与水有较强的亲和力，适用于分离蛋白质等大分子物质，葡聚糖离子交换剂一般以Sephadex G-25和G-50为基质，琼脂糖离子交换剂一般以Sepharose CL-6B为基质。
根据与基质共价结合的电荷基团的性质，可以将离子交换剂分为阳离子交换剂和阴离子交换剂。①阳离子交换剂的电荷基团带负电，可以交换阳离子物质。根据电荷基团的解离度不同，又分为强酸型（磺酸基，—SO3 H）、中等酸型（磷酸基，—PO3 H2）和弱酸型（羧基，—COOH）三类。②阴离子交换剂的电荷基团带正电，可以交换阴离子物质。根据电荷基团的解离度不同，又分为强碱型［季铵基，—N（CH3）3＋］、中等碱型（胺基）和弱碱型（二乙基胺基乙基）三类。
离子交换色谱一般有很高的载样量，其载样量取决于树脂的交换能力，最高可达5mg/g，因而离子交换色谱常作为生物大分子最初的分离手段。
离子交换色谱担体上的最常见官能团：①强碱性，pH＞13，TM AE（三甲基胺基乙基），—CH2 CH2 N（CH3）3＋；②弱碱性，pH9.5～11，DMAE（二甲基胺基乙基）—CH2 CH2 N（CH3）2，DEAE（二乙基胺基乙基）—CH2 CH2 N（CH2 CH3）2；③弱酸性，pH4.5，羧基，—CH2 COOH；④强酸性，pH＜1，磺酸基，—CH2 CH2 SO3 H。
（3）离子交换树脂的性能
1）粒度：色谱用离子交换树脂一般为60～120目或更细一些。颗粒越细，达到交换平衡的速度就越快。但颗粒过细，在色谱过程中流速太慢，需要加压或减压来调节流速。颗粒的细度可根据被分离物质的性质和实际情况来决定。
2）交联度：合成强酸性阳离子交换树脂的二乙烯苯就是交联剂。所谓交联度就是二乙烯苯在苯乙烯和二乙烯苯的混合物中所占的质量分数。交联度越大的树脂表示二乙烯苯的含量越高，网状结构越密，吸水膨胀越小，树脂越不容易破碎。一般应用时阳离子交换树脂以8交联度为宜，阴离子交换树脂以4%交联度为宜。在分离大体积离子时如生物碱，可选用2%交联度的树脂，生物碱在这种树脂中不但交换速度快，而且交换后容易被洗脱下来。
3）交换量：离子交换树脂的交换量与树脂内所含的酸、碱性基团数目的多少有关。通常每1g树脂所含基团的毫克当量数称为交换当量，指总交换容量。一般树脂的交换当量为3～6毫克当量/g。在实际实验中，色谱柱与样品中各个待分离组分进行交换时的交换容量，不仅与离子交换剂有关，还与实验条件有关，一般又称为有效交换容量。
交联度越大的树脂，对大体积离子的交换量就越小。通常阳离子交换树脂，样品可加到理论交换量的1/2；而阴离子交换树脂，则样品只能加到理论交换量的1/4～1/3。
4）溶胀：每1g干燥的树脂能吸收50%左右的水，吸水后树脂的体积增大。当外界溶液的离子浓度增大时，吸水量降低，树脂会发生收缩。弱酸性和弱碱性树脂在转型时体积会发生显著变化，使用时需要注意。
（4）影响离子交换的因素
1）溶液的pH值：实际上离子交换剂就像一个高分子的不溶性的酸或碱，因此溶液的pH值对离子交换产生很大的影响。由于同离子效应，当溶液中的氢离子浓度显著增大时，必然会抑制阳离子交换剂中酸性基团的解离，所以此时离子交换反应就会大大降低，甚至不能进行。一般强酸型阳离子交换剂的pH值不应小于2，弱酸型交换液的pH值应在6以上。同样在阴离子交换剂中，当溶液pH值增大时，亦会发生同样的情况，所以强碱性阴离子交换树脂交换液的pH值应在12以下，弱碱性的则应在7以下。同时pH也影响样品组分的带电性，尤其对于蛋白质、多肽等两性物质。
2）被交换物质在溶液中的浓度：由于离子交换操作通常是在水溶液或含有水的极性溶液中进行的，有利于被分离交换化合物的解离和交换。但是溶液浓度也有影响：①低浓度时离子交换剂对被分离物质交换的选择性较大；②高浓度时不仅被分离物质的解离度会降低，而且也会影响到离子交换剂对被分离物交换的选择性和交换顺序；③如果浓度过高，亦会引起离子交换剂表面及内部交联网孔的收缩，影响离子进入网孔。所以，在进行离子交换色谱时所用的溶液浓度应较稀，这样有利于被分离物质的提取分离。
3）被交换的离子：离子交换剂对被分离物质的交换能力主要与被分离物质的解离度、溶液的酸碱性、解离离子的半径和解离离子的电荷等有关。解离度越大，酸碱性越强，越容易被离子交换剂交换，但洗脱起来也越难。解离离子的化合价越高，电荷越大，离子交换剂对它的交换力就越强。
4）温度的影响：低浓度时温度对离子交换剂的交换性能影响不大。但当浓度在0.1当量以上时，温度升高会使水合倾向大的离子的交换能力增强，同时亦会增加离子的活性系数，影响弱酸、弱碱离子交换剂的交换率。通常温度升高离子交换速度加快，在洗脱时亦可提高洗脱能力。但对于不耐热的离子交换剂应注意调节温度，以免造成离子交换剂的破坏。
5）溶剂的影响：因为溶剂的极性对被分离物的解离度有影响，故在水溶液或含水的极性溶剂中离子交换都能进行；但在极性小的溶剂中不仅难以进行交换或不进行交换，而且还会使选择性减少或消失。(www.xing528.com)
6）其他影响因素：树脂的交联度越大，结构中的网眼就越小，大离子就越不容易进入，反之亦然。交联度的大小可以影响离子交换剂对被分离物质的选择性。树脂颗粒的大小也会影响交换速度，颗粒越小，表面积就越大，就越有利于交换剂与溶液中离子的接触，从而增加交换速度。此外，因为强酸型、强碱型离子交换剂的交换基团的离解能力强，故它们容易与溶液中的离子交换。
（5）离子交换柱色谱的一般操作：在色谱柱中的待分离物会随流而下相继与新树脂接触，不会产生逆交换。如果有两种以上的离子，还可以利用离子交换能力的差异将各成分分别洗脱，从而达到分离的目的，所以离子交换色谱一般都在柱中进行。具体包括如下内容：
1）离子交换树脂的预选：普通的树脂颗粒都较大，一般在20～35目，亦有50目的可直接进行天然药物成分的粗提和初步分离。离子交换色谱一般需要更细一些的树脂，所以需要将它干燥、粉碎、过筛或利用浮选法进行选择。
2）装柱：①将离子交换树脂置于烧杯中，加水后充分搅拌，赶尽气泡，放置，待大部分树脂沉降后，倾去上面的泥状微粒；②重复上述操作至上层液透明为止；③在色谱柱的底部放一些玻璃丝，厚度1～2cm即可；④在树脂中加入少量水，搅拌后倒入保持竖直的色谱柱中，使树脂沉降，让水流出；⑤最后在色谱柱的顶部加一层干净的玻璃丝，以免加液时把树脂冲散。
3）离子交换树脂的预处理：新树脂中含有合成时混入的小分子有机物和铁、钙等杂质，以Na型或Cl型存在，所以在使用前都要进行预处理。预处理的目的：一是除去杂质，二是将Na型或Cl型转为H型或OH型。首先用蒸馏水将新树脂浸泡1～2天，充分溶胀后，将其装在色谱柱中并根据树脂型号不同依法处理：①强酸型阳离子交换树脂的预处理：先用树脂体积20倍量的7%～10%盐酸（这类新树脂通常是Na型）以1m l/（min・cm2）（色谱柱横截面积）的流速进行交换，树脂转为H型后，用水洗至洗脱液呈中性；然后再用树脂体积10倍量的4%氢氧化钠（或食盐）进行交换，转为Na型后，用水洗至洗脱液中不含钠离子；重复上述操作（Na型转为H型，H型再转为Na型，反复操作的目的，一是除去树脂中的杂质，二是活化树脂，提高交换能力），最后以树脂体积10倍量的4%盐酸将其转为H型，并用蒸馏水洗至流出液呈中性。②强碱性阴离子交换树脂的预处理：先用树脂体积20倍量的4%氢氧化钠水溶液（这类新树脂通常是Cl型）将其转变成OH型，并用树脂体积10倍量的水进行洗涤，然后再用10倍量的4%盐酸将其转变为Cl型，并用蒸馏水洗至流出液呈中性；重复上述操作（Cl型转为OH型，OH型再转为Cl型），最后再用以树脂10倍量的4%氢氧化钠将其转成OH型。因OH型树脂在放置过程中易吸收空气中的二氧化碳，故保存时要注意；多数是临用时才将其从Cl型转变成OH型。
4）样品的交换：①将一定浓度的天然药物提取液以适当的流速通过离子交换树脂柱（亦可将样品溶液反复通过离子交换色谱柱，直到被分离的成分全部被交换到树脂上为止）；②然后用水洗涤，除去附在树脂柱上的杂质。在这一过程中，当样品溶液通过离子交换树脂柱时，亲和力强的离子先被交换而被吸附在色谱柱的上部，亲和力弱的离子后被交换而被吸附在色谱柱的下部，不被交换的物质通过树脂而从柱中流出。
5）样品的洗脱：当用一种洗脱剂进行洗脱时，亲和力弱的（被交换在色谱柱下部的离子）离子先被洗脱下来。常用的洗脱剂有酸、碱、盐及不同pH的缓冲溶液、有机溶剂等，既可以是单一浓度，也可以是浓度梯度（浓度由低到高）。对于总碱性物质（如生物碱）的洗脱，可用氢氧化钠、氨水等先进行碱化，使生物碱转变为游离型，然后再用有机溶剂进行回流洗脱或从色谱柱中直接进行洗脱；对于总酸性物质（如有机酸）的洗脱，则先可用酸先进行酸化，使有机酸转变为游离型，然后再用有机溶剂进行洗脱。
6）离子交换树脂的再生：离子交换树脂是一类可反复使用的大分子吸附剂。使用过的树脂，如果还要继续交换同一个样品，可把盐型转换为游离型即可继续使用。如果要交换其他样品，则需用预处理的方法进行再生，然后再继续使用。如果一段时间不用，则可加水后将其保存在广口瓶中。
（6）离子交换柱色谱的应用：在天然药物有效成分研究中，离子交换色谱主要是用于氨基酸类、肽类、生物碱类、有机酸类、酚类及蛋白质等化合物的分离纯化。
1）混合物的初分：将天然药物的水提液依次通过阳离子交换树脂和阴离子交换树脂，然后再分别洗脱，即可获得碱性（阳离子交换树脂的洗脱物）、酸性（阴离子交换树脂的洗脱物）和中性（阳离子树脂和阴离子树脂均不吸附的物质）三部分提取物。
2）酸、碱或氨基酸的分离：将天然药物的酸水提取液直接通过阳离子交换树脂，然后碱化，用有机溶剂洗脱，可获得总生物碱或总碱性物。将天然药物的碱水提取物直接通过阴离子交换树脂，然后酸化，用有机溶剂洗脱，可获得总有机酸或总酸性物。此外，离子交换色谱对于氨基酸的分离也是一个很有效的方法，通常可用不同pH的缓冲溶液梯度洗脱从而达到分离的目的。
3）蛋白质、多肽的分离：当待分离的肽或蛋白质为碱性时，可选用阳离子交换色谱。阳离子交换色谱的流动相通常采用磷酸盐（p K a＝2.1）、甲酸盐（p K a＝3.7）和醋酸盐（p K a＝4.8）的缓冲溶液。当待分离的蛋白质在一定条件下以负电荷为主时，应采用阴离子交换色谱进行分离，可选用浓度递增的盐（如NaCl）溶液将蛋白质从色谱柱上洗脱下来。被分离分子的电荷密度越大，要求洗脱液的离子强度越大。
4）黄精属植物中氨基酸的分离：①取黄精属（Polygonatum）植物的新鲜根4kg；②用水提取，水提取液浓缩至1000m l，过滤；③滤液通过Zeo Karb 215强酸型阳离子交换树脂（H型），用3000m l水洗涤离子交换树脂；④继用1200m l 0.5mol/L氨水进行洗脱，合并含有氨基酸（用茚三酮试剂检测）的洗脱液；⑤洗脱液浓缩至1000m l，调pH5；⑥将此溶液再次通过Zeo Karb 215强酸型阳离子交换树脂；⑦然后依次用1500m l水、0.5mol/L氨水洗脱，氨基酸开始出柱后（用茚三酮试剂检测）进行分步收集，每份2m l；⑧以纸色谱进行检查，合并相同组分，在1～30份中获得天门冬氨酸，31～459份中获得氮杂环丁二烯-2-羧酸，460～505份中获得丝氨酸和苏氨酸，506～534份中获得高丝氨酸，615～667份中获得天门冬酰胺、γ-氨基丁酸，668～750份中获得赖氨酸和精氨酸。具体结构如下：
5.高速逆流色谱
高速逆流色谱（high-speed countercurrent chromatography，HSCCC）是一种连续高效的液-液分配色谱分离技术。该技术依靠聚氟乙烯的蛇形分离管的方向性和特定的高速行星式旋转所产生的离心场作用，使无载体支持的固定相稳定地保留在分离管中，并使样品和流动相单向、低速通过固定相，实现了充分的混合，混合物中各组分由于在两相溶剂中的分配系数的不同而逐渐分离。在天然药物化学中主要用于皂苷、生物碱、酸性化合物、蛋白质和糖类等分离纯化。
（1）高速逆流色谱的分离原理：基于样品在旋转螺旋管内的互不混溶的两相溶剂间分配系数的不同而实现分离。HSCCC利用了一种特殊的流体动力学（单向流体动力学平衡）现象，即在一根100多米长的螺旋空管，注入互不混溶的两相溶剂中的一相作为固定相，然后做行星运动，同时不断注入作为流动相的另一相，由于行星运动产生的离心力场使固定相保留在螺旋管内，而流动相则不断穿透固定相，因此在螺旋管中两相溶剂实现了高效的接触、混合、分配和传递。由于样品中各组分在两相溶剂中分配系数的不同，因而能使样品中各组分得到分离。
（2）高速逆流色谱中的溶剂选择：正确地选择溶剂系统是HSCCC成功分离的关键，但至今溶剂系统的选择还没有充分的理论依据。根据被分离物质的类型参照文献记载选择极性适合的溶剂系统，也可参照TLC、HPLC结果，调节各种溶剂的相对比例，测定被分离组分的分配系数，最终选择合适的溶剂系统。所用的溶剂系统分三类：①水体系，由极性小的非水相与水相组成，两相极性相差很大；②亲油体系，由高极性的非水相与水相组成，两相极性相差不大；③中间体系，是处于前两者之间的。溶剂体系的选择原则：①溶剂体系的分层时间小于30秒；②目标样品的分配系数K在0.2～0.5范围内；③容量因子接近于1；④分离因子大于1.5。常用溶剂体系：①正己烷-乙酸乙酯-正丁醇-甲醇-水（5∶1∶1∶1∶1）和正庚醇-乙酸乙酯-甲醇-水（6∶1∶6∶1）适于分离弱极性和非极性物质；②三氯甲烷-甲醇-水（6∶3∶3）和正丁醇-乙酸乙酯-水（3∶2∶5）适于分离极性大的物质。可根据被分离组分的分配系数调整溶剂组成：①可用乙醇代替甲醇增加体系的疏水性；②加入盐（醋酸铵等）或酸（三氟乙酸或醋酸）增加体系亲水性。
（3）高速逆流色谱仪与操作：作为一种色谱分离方法，HSCCC与高效液相色谱（HPLC）的最大不同在于其柱分离系统。如果将一套制备HPLC系统的色谱柱部分换成一台HSCCC的螺旋管式离心分离仪，即可构成一套HSCCC色谱分离系统，包括储液罐、泵、螺旋管分离柱、检测器、色谱工作站以及流分收集器等。在实际分离时：①首先选择预先平衡好的互不混溶的两相溶剂中的一相作为固定相，将其充满螺旋管柱；②使螺旋管柱在一定的转速下高速旋转（做行星运动）；③以一定的流速将流动相泵入柱内；④在体系达到流体动力学平衡后（即开始有流动相流出时），将待分离的样品注入体系；⑤混合组分将依据各自在两相溶剂中分配系数的不同实现分离。分离效果与所选择的溶剂系统（固定相和流动相）、洗脱方式、流动相的流速、仪器的旋转方向和转速、样品浓度和进样方式以及柱温等都有密切关系。常用的检测器有紫外-可见光检测器（UV-Vis）、蒸发光散射检测器（ELSD）以及质谱检测器等。较大的制备型HSCCC柱容积可达530m l，一次最多进样可达20g粗品；较小的分析型HSCCC柱容积为8m l，进样量为几十微克，最大转速可达4000r/min，分析能力接近于高效液相色谱。
（4）高速逆流色谱的优点
1）适应性好，应用范围广：因为可选择溶剂系统的组成与配比无限多，理论上HSCCC适用于任何极性范围的样品分离，所以尤其适用于天然药物成分的分离。又因不需固体载体，从而消除了气液色谱中由于使用载体所带来的吸附现象，特别适用于分离极性物质。
2）操作简便，容易掌握：分离过程中对样品的前处理要求低，一般的粗提物即可进行HSCCC的制备分离或分析。
3）回收率高：由于没有固体载体，不存在吸附、降解和污染，样品的理论回收率可达100%。在实验中只要调整好分离条件，一般都有很高的回收率。
4）重现性好：如果样品的表面活性作用不强，酸碱性也不强，则分离过程稳定，重现性好。
5）分离效率高，分离量较大：HSCCC能实现梯度操作和反相操作，亦能进行重复进样，使其特别适用于制备性分离，且产品纯度高。一台普通的高速逆流色谱仪一次进样可达几十毫升，一次可分离近10g的样品。
（5）高速逆流色谱法的应用：HSCCC可采用不同物化特性的溶剂体系和多样性的操作条件，具有较强的适应性，为从复杂的天然药物粗提物中分离不同特性（如不同极性）的有效成分提供了有利条件。因此，HSCCC被广泛用于天然药物化学成分的分析和制备分离，并积累了宝贵的经验。例如：①粉防己粗提物的分离选用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（3∶7∶5∶5）溶剂系统；②红豆杉粗提物的分离选用正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水（6∶3∶2∶5）或正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（1∶1∶1∶1）溶剂系统；③紫杉醇的制备分离采用石油醚（30～60℃）-乙酸乙酯-甲醇-水（50∶70∶80∶65）溶剂系统；④肉桂酸、阿魏酸、咖啡酸混合物的分离采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（3∶7∶5∶5）溶剂系统；⑤马钱子碱和番木鳖碱的分离选用三氯甲烷-0.07mol/L磷酸钠-0.04mol/L柠檬酸缓冲液体系（pH5.8）（1∶1）；⑥黄连生物碱的制备分离选用三氯甲烷-甲醇-0.1mol/L盐酸（4∶1.5∶2），下相作流动相；⑦银杏叶提取物的分离选用三氯甲烷-甲醇-水（4∶3∶2）溶剂系统，得到4′，5，7-三羟基黄酮醇、异鼠李糖、槲皮苷纯品。
6.快速色谱
快速色谱（flash chromatography，FC）是一种价格低廉、操作简便、易得的常规方法。采用快速色谱可以有效地缩短常压柱色谱的操作时间（FC的压强约2.02×105 Pa），尽量避免了化合物的死吸附。
（1）快速色谱装置组成主要包括：①色谱柱，长度7～15cm，直径3～10cm，采用干法或湿法装柱；②溶剂贮瓶；③针式阀门，在气体入口处控制压缩气体的流速。加样后，可施加高于1bar的压强，加速样品的洗脱。利用不同规格的色谱柱对0.01～10g样品进行分离，所用时间通常不超过15分钟。
（2）快速色谱的固定相：快速色谱中使用最广泛的固定相是硅胶，其粒度范围较窄。主要商品有：Baker公司、Aldrich公司、Tokyo Rikakikai公司等的系列色谱柱；Biotage径向柱压缩系统每次可分离1～250g的样品，最大流速可达250m l/min（压强可达7bar），有两种型号：①Flash75型为直径7.5cm的色谱柱（可装200g，400g或800g，KP-Sil 32～63μm 60A硅胶）；②Flash150型为一直径15cm的色谱柱（可装2.5kg或5kg，KP-Sil32～63μm 60A硅胶）。
（3）快速色谱的应用
1）海绵中Cheilanthane型二倍半萜类化合物的分离：海绵（Ircinia属）中含有蛋白激酶抑制剂——Cheilanthane型二倍半萜类化合物。①海绵Ircinia sp.经冷冻干燥，研成细粉；②用二氯甲烷提取得274g浸膏；③经正己烷和含水甲醇（9∶1）依次捏溶，分别回收溶剂，得到混合物Ⅰ和Ⅱ；④混合物Ⅱ经反相C18快速柱色谱（15×5cm，Davisil 30～40μm），依次用水-甲醇洗脱和甲醇-乙酸乙酯梯度洗脱；⑤经检测，甲醇-乙酸乙酯（1∶1）为活性部分；⑥经半制备型HPLC分离得到Cheilanthane型二倍半萜类化合物。
2）Cycloartane型三萜及其氢过氧化合物的分离：凤梨科植物Tillandsia recurvata中含有Cycloartane型三萜及其氢过氧化合物。①用硅胶干柱快速色谱分离，依次用己烷、己烷-二氯甲烷及二氯甲烷洗脱；②对二氯甲烷洗脱部分进行C18反相硅胶干柱快速色谱分离，用甲醇-水洗脱得到氢过氧化合物；③经半制备型H PLC分离得到氢过氧化合物。
7.中压液相色谱
中压液相色谱（medium-pressure liquid chromatography，M PLC）可采用更长、具有更大内径的色谱柱，可以一次性分离更多的样品。中压液相色谱比低压液相色谱使用的填料颗粒度更小，需使用更大的压强［M PLC的压强约（5.05～20.2）×105 Pa］来维持适当的流速，所以要求柱承受的压强较高，通常色谱柱的表面涂有一层耐压的材料。中压液相色谱与常规的柱色谱、快速色谱相比，具有更高的分辨率和更短的分离时间。
（1）中压液相色谱的装置组成主要包括：①各种规格的中压色谱柱，柱体积130～1880m l，可用于分离0.1～100g的样品，色谱柱由带有塑料保护膜的强化玻璃制成，可以观测到分离的进展情况；②活塞泵及可替换泵头，中压液相色谱所需压强由压缩空气或往复泵提供，在最大压强为40bar时，可使流速在3～160m l/m in之间调节；③溶剂梯度形成装置；④各种紫外检测仪检测。常用的中压液相色谱系统有Büchi B～680A系统、Labomatic装置、C.I.G色谱柱系统、K ronlab/Stagroma系统等。
（2）中压液相色谱柱：固定相颗粒一般在25～200μm（最常用的填料尺寸是15～20μm，25～40μm或40～63μm），可采用湿法或干法装柱。①应用键合固定相时，常采用湿法装柱；②在进行中压硅胶柱色谱分离时，用干法装柱可使固定相填充密度比湿法装柱提高20%。干法装柱：①装填时，先将固定相加入连于柱顶的容器内，当固定相装完后，应使容器内多出的固定相体积足以装填10%体积的色谱柱；②将该装置与氮气钢瓶相连；③打开色谱柱出口，施加10bar的氮气压强直至填料的高度维持恒定；④关闭氮气阀门，先使柱内的压强降至与柱外相同，再对色谱柱进行调节。在制备型色谱柱前连一前置柱，在每次分离后将被污染的填料除去，利用甲醇→乙酸乙酯→己烷的顺序冲洗对硅胶固定相进行再生。
可用注射器将样品直接加到色谱柱上或使用进样器进样。中压液相色谱的溶剂系统选择可参考TLC和HPLC的溶剂条件。虽然该类色谱柱的最大承受压强只有40bar，但使用颗粒度为15μm的固定相可以获得同HPLC柱类似的分离效果。
（3）中压液相色谱的应用
1）Eudesmane型倍半萜类化合物的分离：中国民间草药乌药（Lindera strychnifolia）的根中含有Eudesmane型倍半萜类化合物。通过硅胶柱色谱分离，中压柱色谱（prepacked Si-5柱，22mm×100mm id.），正己烷-三氯甲烷（2∶3）为洗脱剂分离得到三个新的Eudesmane型倍半萜类化合物。
2）裂环环烯醚萜类成分的分离：植物Chironia krebsii的干燥根中含有裂环环烯醚萜类成分。提取分离过程：①甲醇提取；②葡聚糖凝胶Sephadex LH-20，甲醇洗脱得到10个流分；③流分再经中压液相色谱（LiChroprep RP 8，15～25μm，46cm×2.5cm id，流速10m l/min，压强30bar），甲醇-水（18∶82→50∶50）梯度洗脱得到两个化合物。
8.高压液相色谱
高压液相色谱（high pressure liquid chromatography）即高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC），通常是指所用色谱柱的理论塔板数大于2000，在2000～20000范围内。其色谱柱内填装的固定相是粒度范围较窄的微小颗粒，需采用较高的压强（压强大于20个大气压）保证流动相的流出。在制备型高压液相色谱系统中使用较小颗粒（5～30μm）的固定相，系统的复杂性及成本增大，分辨率得到较大的提高。在天然产物纯化的最后阶段，常使用10μm或更小颗粒的高效填料。适用于高沸点不易挥发、相对分子质量大、不同极性的天然药物化学成分的分离和分析。
（1）高效液相色谱主要由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成。H PLC的输液泵要求输液量恒定平稳；进样系统要求进样便利、切换严密；由于液体流动相黏度远远高于气体，为了减低柱压，高效液相色谱的色谱柱一般比较粗，长度也远小于气相色谱柱。半制备型分离是指色谱柱直径在8～10mm，内装颗粒度为10μm的固定相，可用于1～100mg混合物样品的分离，对于更大量样品的分离可通过反复进样实现分离。Waters公司的Symmetry C8和C18色谱柱，分别内装3.5，5和7μm三种颗粒度的固定相，三种颗粒度的固定相对样品具有相同的选择性。如Symmetry C18色谱柱（3.5μm，3.9mm×100mm）的洗脱剂条件可以直接转换应用于Symmetry C18色谱柱（7μm，19mm×150mm）样品分离，两者之间只需适当调整洗脱剂的流速。
（2）高效液相色谱的工作原理：高效液相色谱从原理上与经典的液相色谱没有本质的差别。使用高压液相色谱时，样品溶液被注入色谱柱，通过压力在固定相中移动，由于样品溶液中的不同物质与固定相的相互作用不同，按不同的顺序离开色谱柱，通过检测器得到不同的峰信号，达到彼此分离的目的。操作步骤如下：①储液器中的流动相由高压泵打入系统；②样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱（固定相）内，由于样品溶液中的各组分在两相中的分配系数不同，在两相中做相对运动时，经过反复多次的吸附-解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出；③通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式打印出来。
（3）高效液相色谱的主要特点：①高压输液泵，压强可达150～300kg/cm2；②高效微粒固定相，理论塔板数可达5000/m，在一根柱中同时分离可达100种成分；③高灵敏度检测器，紫外检测器灵敏度可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg；④实现了高速分离，流速为0.1～10m l/min，通常分析一个样品在15～30min，有些样品甚至在5分钟内即可完成。制备型高压液相色谱分离大多采用恒定的洗脱剂条件，对难分离的样品采取梯度洗脱。与中压液相色谱的洗脱剂选择条件一样，半制备型高压液相色谱的洗脱剂条件也可由分析型高压液相色谱的洗脱剂条件确定。
（4）高效液相色谱的应用
1）乌檀（Nauclea orientalis）中吲哚类生物碱的分离：Phenomenex Prodigy ODS（10μm）色谱柱，规格20mm×250mm，流动相为甲醇-水（88∶12）。
2）蒙桑（Morusmongolica）中细胞毒黄酮类化合物的分离：Pegasil Si60（5μm）色谱柱，规格10mm×250mm，流动相为正己烷-乙醚（1∶11）。
3）香石竹（Dianthus caryophy llus）中环状结构的花青素的分离：Wakosil-Ⅱ5 C18 AR（5μm）色谱柱，规格20mm×250mm，流动相为甲酸-水-乙腈（10∶50∶40）。
4）Rothmanniamacrophy lla中环烯醚萜类的分离：Prep ODSⅡ色谱柱，规格20mm×250mm，流动相为甲醇-水。
5）枇杷（Eviobotrya def lexa）中三萜酸类化合物的分离：①Hyperprep ODS色谱柱，规格10mm×250mm，流动相为乙腈-水（60∶40）；②Hyperprep HS Silica色谱柱，规格10mm×250mm，流动相为二氯甲烷-乙酸乙酯（3∶7）。
【思考题】
1.超声提取的原理和特点是什么？
2.微波有哪些特性？影响微波提取的因素有哪些？
3.何谓超临界流体萃取技术？原理是什么？
4.夹带剂的加入对超临界流体萃取有哪些影响？
5.简述膜分离技术的原理及应用。
6.简述吸附澄清剂的分类及主要吸附澄清剂的实际应用。
7.简述分子蒸馏的原理及特点。
8.简述各种色谱技术的原理及应用。
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