结晶法：生物碱盐类化合物析晶的选择与优化

2.3.1　结晶法

天然药物化学成分在常温下一般都以固体状态存在，大多数具有晶体的特性，可以通过改变溶剂中溶质的溶解度析出结晶达到分离制备纯品的目的。一旦获得晶体，就能有效地进一步精制成为单体纯品。纯化合物晶体具有一定的熔点和晶体学特征，有利于进行结构鉴定。因此，得到晶体并制备成纯品单体化合物，就成为生产高纯度天然药物以及鉴定天然药物分子结构的重要步骤。

溶液中的某种化学成分达到过饱和浓度，在一定的条件下，就会以晶体析出，通过过滤等手段将晶体和母液分开，达到分离纯化的目的。晶体一般是纯度较好的单体化合物，但也有以共结晶形式析出的混合物，即使这样，也可以与不结晶的母液部分分开。此外，有些物质即使达到了很纯的程度，还不能结晶，而呈现不定形粉末状态。天然药物中有些游离生物碱、皂苷、多糖、蛋白质经常不能结晶或不容易结晶，这时可以通过制备结晶性的衍生物或盐的方法得到晶体。

初次析出的晶体往往带有一些杂质，需要通过反复结晶，才能得到纯粹单一的晶体。结晶是指从饱和溶液中析出具有一定几何形状的固体的过程；而将不纯的晶体利用溶剂溶解、过滤、脱色、除杂，再析出结晶得到较纯晶体的精制过程，称为重结晶。

1.结晶的条件

（1）目标成分的含量：一般认为物质在溶液中达到一定纯度才能析出结晶，其在溶剂中含量愈高愈容易获得晶体。某些化合物需要纯度比较高时才能得到晶体；有些化合物含量并不高，但如果选择条件得当，也可获得晶体。如喜树根的三氯甲烷提取部分中喜树碱含量很低，选择三氯甲烷甲醇混合溶剂进行处理可以获得喜树碱粗晶体。大多数的天然药物分子第一次得到晶体后，可以通过反复重结晶，使其纯度得到提高，直到恒定为止。

（2）合适的溶剂条件：选择合适的溶剂是获得结晶至关重要的条件。有时有效成分在待分离部位中含量很高，由于溶剂选择不当，不能得到结晶；反之，有时其含量并不高，但选择了合适的溶剂，也可以获得结晶。此外同一化合物在几种不同溶剂中都能析出结晶，其晶形也不相同，这时应根据获得晶体的形状、质地，晶体的纯度等多方面进行综合评价选择。

（3）有效成分在所选择的溶剂中的浓度：一般来讲，浓度高些容易结晶；但浓度过高时，在溶液的黏度增大的同时杂质的浓度也相应增高，反而阻止晶体的析出。实际工作中常常将较稀的溶液放置，待溶剂自然挥发到适当的浓度和黏度，即能析出晶体。

（4）合适的温度和时间：温度低时利于析晶。如果在室温久置不析出晶体，可以放置在冰箱或阴凉处。而且结晶的形成需要放置较长时间，有时甚至需要放置3～5天或者更久才能析出晶体。

（5）制备盐类和衍生物：某些化合物由于其结构特性即使纯度很好也不结晶，而其盐或乙酰化衍生物（如含—OH等基团化合物）等却易于结晶。如生物碱可与各种有机酸或无机酸结合成盐；有机酸可形成钾、钙、钠、铵等盐而析出晶体。制备衍生物主要根据有效成分的活性基团，羟基化合物可以转化成乙酰衍生物或苯甲酰衍生物、羰基化合物可以制成肼类化合物、内酯可以开环成盐而析出晶体。制备何种衍生物主要应考虑它是否能够容易地恢复成原来的化合物。

2.结晶溶剂的选择

溶剂选择的原则：①该溶剂对待结晶化合物的溶解能力随温度有很大变化，当温度高时对化合物具有很好的溶解能力，随着温度的降低，溶解能力大大减弱；②该溶剂对杂质冷热都不溶解或冷热全能溶解；③沸点不宜过高，利于挥尽，避免在晶体表面存在残留；④要考虑所用溶剂的安全性，如对人体的毒害程度、是否易燃等；⑤还要考虑溶剂的成本核算等问题，尽可能不用或少用混合溶剂。

结合“相似相溶”规则以及结晶化合物的极性大小，确定合适的结晶溶剂：①游离生物碱易溶于苯、乙醚、三氯甲烷、乙酸乙酯及丙酮等亲脂性溶剂；②生物碱盐类则不溶于上述亲脂性溶剂，大多数能溶于乙醇、甲醇或水；③苷类化合物可溶于各种醇（从甲醇到戊醇）、丙酮、乙酸乙酯、三氯甲烷等，难溶于乙醚和苯（各类型的苷类化合物，由于苷元部分不一样，其溶解性能差别较大）；④氨基酸在水中溶解度很大，可考虑在甲醇或乙醇中结晶；⑤其他大部分中性物质由于基本结构不同，溶解度没有规律，需要先查阅同类型化合物的相关文献，了解同类化合物的极性、溶解性质和结晶溶剂条件，再通过小量摸索实验加以确定结晶溶剂。(www.xing528.com)

常用溶剂有石油醚、苯、乙醚、四氯化碳、三氯甲烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇、水等。具体选择时将欲结晶的物质在上述各种有机溶剂中测试溶解度，包括冷时和热时的溶解度。选择溶剂时常选用在加热时能全溶，放冷时能析出的溶剂。由于乙醇结构中具有脂溶性和水溶性基团，还具有经济安全的特点，因此一般首选乙醇进行结晶实验。如果常用溶剂不能析晶，再考虑如二氧六环、二甲基亚砜、乙腈、甲酰胺、二甲基甲酰胺及其他酯类等不常用的有机溶剂，或再考虑选择混合溶剂。混合溶剂一般是由易溶的溶剂和难溶的溶剂组成。将欲结晶的化合物先溶于易溶的溶剂中，在加热的情况下滴加难溶的溶剂直至出现浑浊，再加热溶解或滴加易溶的溶剂使其全部溶解后放冷静置析晶。例如，甲醇或乙醇对生物碱的盐类化合物溶解性较好，在结晶时往往加入乙醚等溶剂促进其结晶析出。在选择混合溶剂时，最好选择易溶的溶剂沸点低，难溶的溶剂沸点高，两者混合放置后，先塞紧瓶塞看其是否能结晶，如不结晶，可打开塞子，随着低沸点溶剂的挥发比例逐渐减少，沸点高的溶剂溶解效果不好，慢慢析出结晶，达到很好的析晶效果。

除选择有机溶剂外，有些天然产物也可使用水或酸水进行结晶。如小檗碱可在水中结晶；石蒜碱可在5%盐酸溶液中成盐析出结晶，这是最经济、方便的析晶溶剂。

重结晶用的溶剂一般可参照结晶时使用的溶剂，也可以改变，因为结晶后样品纯度发生变化，与原来混有杂质时溶解度也发生了变化。必要时仍需进行小量试验确定溶剂。有时需利用两种不同的溶剂分别进行重结晶，如利用甲溶剂重结晶去除一种杂质，再利用乙溶剂重结晶去除另一类杂质，才能得到纯品晶体。例如，石蒜科植物中所含有的一种生物碱多花水仙碱（tazettine）需要分别在甲醇和丙酮中进行两次重结晶才能得到纯品晶体。

在结晶或重结晶过程中切记避免有效成分与溶剂结合成加成物或形成含有溶剂的晶体。如汉防己乙素在丙酮溶剂中形成加成物的晶体；千金藤素（cepharanthine）能与苯形成加成物晶体。此外，由于重结晶所用溶剂的不同，析出结晶的晶形不同，导致熔点产生很大差异。如血根碱（sanguinarine）游离碱在乙醇、三氯甲烷和乙醚三种溶剂中分别析出的晶体熔点差异很大，分别为195～197℃（乙醇）、242～243℃（三氯甲烷）和266℃（乙醚）。

在结晶过程中还存在分步结晶，即将结晶后所得母液再经处理又可以分别析出第二批、第三批晶体，这种方法称为分步结晶法或分级结晶法。值得注意的是，分步结晶法各部分所得到的晶体，其纯度往往有很大的差异，常常可以获得一种以上的晶体成分，例如从蛇床子中通过分步结晶法可以分别获得蛇床子素（osthole）和欧前胡素（imperatorin）两种化合物，因此在检查前切不可贸然将所得各部分晶体合并在一起。

3.工业结晶方法

工业化生产中常常利用形成过饱和溶液的方式进行结晶操作。因此根据形成过饱和溶液的方法将结晶方法和结晶设备分为三类：

（1）直接冷却法：是利用单纯的冷却方式形成过饱和溶液进行结晶操作的方法。这种方法操作过程中无明显溶剂蒸发过程，使用的设备是冷却式结晶器。

（2）蒸发浓缩法：是利用蒸发的方式浓缩溶剂使其达到过饱和溶液进行结晶的操作方法。所用设备是蒸发式结晶器。

（3）绝热蒸发法：绝热蒸发法又称真空结晶法，是在真空状态下进行闪式蒸发溶剂，在绝热状态下冷却进行结晶的方法。该方法结合了溶剂蒸发和冷却两种操作达到过饱和溶剂状态。所用设备是真空式结晶器。

此外还有其他的分类方式，如分批结晶和连续结晶；搅拌式和非搅拌式结晶方式。

进行结晶操作时，必须注意以下几方面问题：①若蒸发或冷却过快，溶液的过饱和程度过高，析出结晶速度过快，会导致溶液中晶核过多，析出大量的小晶体；如果放慢蒸发或冷却的速度，溶液处于过饱和程度较低的状态，晶体缓慢生长，会得到少量的大晶体；②若希望获得均匀的晶体，需要不断进行搅拌，保持溶液的温度以及流体动力学均匀性，这是析出均匀晶体的必需条件；③为了保持晶体均匀，冷却降温时保持稳定的降温过程，使液体整体处于均匀降温过程，从而保持溶液的过饱和程度不发生变化。