羊布氏杆菌病实验室诊断方法简介

118.如何进行羊布鲁菌病的实验室诊断？

羊布氏杆菌的实验室诊断可用细菌学检查、血清学实验及变态反应等方法。

（1）细菌学检查　包括直接镜检和分离培养。其方法步骤为：①采集病料。最好采集流产胎儿的胃内容物、肺、肝、脾和流产胎盘及羊水；②病料涂、抹片，作革兰染色和柯兹罗夫斯基（鉴别染色法）染色，镜检，若发现革兰阴性、鉴别染色呈红色的球杆菌或短小杆菌，即可做出初步诊断；③将病料接种于含5%～10%马血清的胰化酪蛋白大豆胨琼脂等培养基2板（若为污染病料，在100毫升培养基中加入结晶紫6000国际单位，或多黏菌素E2500国际单位），分别置大气环境或5%～10%CO₂环境，37℃培养。每3天观察1次，如有细菌生长，可挑选可疑菌落（菌落大小不等，直径一般为0.5～1.0毫米，无色透明、表面光滑湿润、有光泽、透光呈淡黄色及侧光呈现微乳色和略带蓝灰色）做涂片、染色、镜检，做鉴定；若无细菌生长，则继续培养30天。

（2）血清学试验　方法有多种，凝集反应因其特异性和敏感性均较高，且操作较简便，目前得以广泛应用。羊感染布鲁菌7～15天左右，血液中即出现凝集素，随后凝集素滴度逐渐增高，可持续很长时间。在大规模羊群检疫时，常先用平板凝集试验或乳汁环状试验进行初筛试验，以试管凝集试验和补体结合试验进行最后确诊。

①平板凝集试验

a.试剂与材料

ⅰ.抗原。本方法所用抗原由指定单位提供，按说明书使用。本抗原为淡蓝色的悬浮液，有凝集者须废弃。使用前充分振荡，并使其温度达到20℃左右。

ⅱ.受检血清。受检血清必须新鲜，无明显蛋白凝固，无溶血现象和无腐败气味。加入防腐剂的血清自采血之日算起，最迟于15日内检验。试验前须置于温室中，使其温度达到20℃左右。

ⅲ.阳性血清。由指定单位提供。通常取自人工免疫的家畜，但也可从送检血清中选取。凝集价最好不低于1∶800。

ⅳ.阴性血清。由指定单位提供。

ⅴ.器具。移液器、玻璃板、酒精灯、牙签或火柴棒。

b.操作方法

ⅰ.取洁净玻璃板一块，用玻璃记号笔化成4平方毫米小格，每列5格。

ⅱ.用移液器按表5-2所示先后加血清、抗原、生理盐水、阳性血清、阴性血清（单位：微升）。

ⅲ.用牙签或自血清量少的格开始依次向前搅拌混合。每格血清用一根牙签。用过的牙签要放在固定容器内，工作完毕后，集中烧毁。

ⅳ.混合完毕后，放于酒精灯上稍加温，使之均匀达30℃左右，于5～8分钟内判定结果。

ⅴ.按下列标准用加号记录反应强度

＋＋＋＋：出现大的凝集片或小的颗粒，液体完全透明，即为100%凝集。

表5-2　试验次序

＋＋＋：有明显的凝块，液体几乎完全透明，即为75%凝集。

＋＋：有可见的凝块，液体不甚透明。即为50%菌体凝集。

＋：仅仅可以看出颗粒物，液体浑浊，即为25%凝集。

－：液体均匀浑浊，无凝集现象。

c.试验结果的判定

ⅰ.绵羊、山羊血清40微升，凝集呈“＋＋”以上时，判定为阳性；80微升凝集呈“＋＋”以上时，判为可疑。

ⅱ.可疑反应的羊，经3～4周，须重新采血，检验。如果重检时仍为可疑，则判定为阳性。

ⅲ.将试验结果通知畜主时，须注明凝集价。

②乳汁环状试验（全乳环状反应）

a.试剂与材料

ⅰ.抗原。目前我国生产两种全乳环状反应抗原。一种是苏木素染色抗原，呈蓝色；另一种是四氮唑染色抗原，呈红色。试验时不论哪种抗原，均按乳脂的颜色和乳柱的颜色进行判定。

ⅱ.受检乳。受检乳须为新鲜的全脂乳。凡腐败、变酸和冻结的不能用（采集的乳，夏季应于当天内检查，如保存于2℃时，7天内仍可使用）；患乳房炎及其他乳房疾病母牛以及初乳不适于本法之用；脱脂乳及煮沸过的乳亦不能做环状反应用。

ⅲ.器具。移液器、灭菌小试管、水浴锅。

b.操作办法

ⅰ.采集4个乳头的新鲜全乳相混合后，吸取1毫升盛于灭菌小试管中。

ⅱ.按抗原标签的规定向小试管中加入全乳环状反应抗原1滴（约0.05毫升），充分振荡混合。

ⅲ.置37～38℃水浴中60分钟。

ⅳ.而后，小心取出试管（勿使振荡），立即进行判定。(www.xing528.com)

c.判定标准

强阳性反应（＋＋＋）：乳柱上层的乳脂形成明显红色或蓝色的环带。乳柱呈白色，分界清楚。

阳性反应（＋＋）：乳脂层的环带虽呈红色或蓝色，但不如“＋＋＋”显著，乳柱微带红色或蓝色。

弱阳性反应（＋）：乳脂层环带颜色较浅，但比乳柱颜色略深。

疑似反应（±）：乳脂层环带不甚明显，并于乳柱之分界模糊，乳柱带有红色或蓝色。

阴性反应（－）：乳柱上层无任何变化，乳柱呈均匀浑浊的红色或蓝色。

注意：脂肪较少或无脂肪的牛乳呈阳性反应时，菌体呈凝集现象下沉管底，判定时以乳柱的反应为标准。

③试管凝集试验

a.试剂与材料

ⅰ.抗原。由指定单位提供。本抗原是将布氏杆菌死菌体悬浮于0.5%苯酚（石炭酸）生理盐水中制成。静置时上层为清亮无色或略呈灰白色的液体，瓶底有菌体沉淀，使用时须充分摇匀。我国的抗原是用国际标准标定制造的，抗原的1∶20稀释液对国际标准阳性血清凝集价恰为1∶1000“＋＋”。使用时用0.5%苯酚（石炭酸）生理盐水作1∶20稀释。有霉菌污染或出现凝集块的抗原不能应用。

ⅱ.受检血清。受检血清必须新鲜，无明显蛋白凝固，无溶血现象和无腐败气味。加入防腐剂的血清自采血之日算起，最迟于15天内检验。

ⅲ.阳性血清。由指定单位提供，通常取自人工免疫的家畜，但也可从送检血清中选取，凝集价最好不低于1∶800。

ⅳ.阴性血清。由指定单位提供。

ⅴ.试验用稀释液。0.5%苯酚（石炭酸）10%盐水溶液，用化学纯苯酚（石炭酸）5毫克和化学纯食盐100毫克加至1000毫升蒸馏水中制成，经高压灭菌后备用。

b.操作方法

ⅰ.受检血清的稀释和抗原的加入。一般情况下，山羊、绵羊用1∶25和1∶50两个稀释度。

每份血清用5支小试管（口径8～10毫米），第1、第3、第4、第5管各加入2.3毫升0.5%苯酚（石炭酸）的10%盐水溶液（检验羊血清专用稀释液），第2管不加。用1毫升吸管吸取受检血清0.2毫升，加入第一管中，并混合均匀。混合方法：是将该试管中的混合液吸入吸管内，再沿管壁吹入原试管中，如此吸入、吹出3～4次。混匀后，以该吸管吸取混合液分别加入第2管和第3管，每管0.5毫升。以该吸管将第3管的混合液混匀（方法同前）吸取0.5毫升加入第4管混合后，又从第4管吸出0.5毫升加入第5管，第5管混匀后弃去0.5毫升。如此稀释之后从第2管起血清稀释度分别为1∶12.5，1∶25，1∶50和1∶100。

加入抗原的方法是：先以0.5%苯酚（石炭酸）10%盐水溶液将抗原原液做20倍稀释，然后加入上述各管（第1管不加，留作血清蛋白凝集对照），每管0.5毫升，振摇均匀，加入抗原后，第2～5管各管混合液的容积均为1毫升，血清稀释度从第2管起依次变为1∶25，1∶50，1∶100和1∶200。

Ⅱ.对照管的制作。做了每次试验须做3种对照各1份。

ⅰ.阴性血清对照。阴性血清的稀释和加抗原的方法与受检血清同。

ⅱ.阳性血清对照。阳性血清对照须稀释到其原有滴度，加抗原的方法与受检血清相同。

ⅲ.抗原对照（了解抗原是否有自凝现象）。加1∶20抗原稀释液0.5毫升于试管中，再加0.5毫升0.5%苯酚（石炭酸）10%盐水溶液稀释。

Ⅲ.比浊管的制作。每次试验须配制比浊管作为判定清亮程度（凝集反应程度）的依据，配制方法如下：取本次试验用的抗原稀释液（即抗原原液20倍稀释液）5～10毫升，加入等量的0.5%苯酚（石炭酸）10%盐水溶液，做倍比稀释（稀释倍数为2、4、8、16、32等），然后按表5-3配制比浊管。

表5-3　比浊管配制

Ⅳ.全部试管充分振荡后置于37～38℃恒温箱中22～24小时，然后，取出检查并记录结果。

Ⅴ.记录结果。根据各管中上层液体的清亮度记录凝集反应的强度（凝集价），特别是50%清亮度（即“＋＋”的凝集）对判定结果关系很大。需用比浊管对照判定。

＋＋＋＋：完全凝集和沉淀，上层液体100%清亮（即100%菌体下沉）。

＋＋＋：几乎完全凝集和沉淀，上层液体75%清亮。

＋＋：显著凝集和沉淀，液体50%清亮。

＋：沉淀明显，液体25%清亮。

－：无沉淀，不清亮。

确定每份血清的效价时，应以出现两个“＋＋”以上的凝集现象（即50%的清亮）的最高血清稀释度为血清的凝集价。

c.试验结果的判定

ⅰ.山羊、绵羊于1∶50稀释度出现“＋＋”以上的凝集现象时，被检血清判定为阳性反应；于1∶25稀释度出现“＋＋”以上凝集现象时，被检血清判定为可疑。

ⅱ.可疑反应的羊，经3～4周，须重新采血检验，如果重检时仍为可疑，该羊判定为阳性。