114.如何进行炭疽病的实验室诊断？
炭疽病的实验室诊断包括细菌学检查和血清学检查。
（1）细菌学检查 常做2种试验。
①直接镜检。采集病羊的末梢静脉血或切一点耳尖作涂抹标片；用瑞氏或碱性亚甲蓝染色、镜检，发现大量单在、成对或2～4个菌体相连的短链排列、竹节状的粗大杆菌，即可确诊。
②串珠试验。该试验利用炭疽杆菌对青霉素非常敏感的特性，在培养基中加入少量青霉素即可使长成长链的菌体变为串珠状圆形菌体。特点是简单、敏感、特异性高。可作为炭疽病的快速诊断方法之一。具体方法有液体培养法、固体培养法和串珠荧光抗体法3种。以固体培养法为例，其操作步骤为：在已溶化并保持至50℃左右的营养琼脂9毫升中，加入每毫升5国际单位的青霉素溶液1毫升，迅速混匀并倾注入平板（使琼脂厚度约达2毫米），凝固后以无菌切成1厘米见方的琼脂块，置于清洁载玻片上。取1铂耳幼龄（培养6小时左右）被检菌的肉汤培养物置于该琼脂块中央，并覆以洁净玻片，放入有湿棉球的无菌平皿中，于37℃培养2～3小时，直接涂片、染色、镜检观察，若菌体膨大呈串珠状圆形即可确诊。
应注意病料的正确采集和处理。疑似炭疽病例死亡的病羊严格禁止解剖，病料可采集尸体的末梢血液，或切下一小块耳尖，必要时，腹部切一小口，取出小块脾脏。注意切割部位的消毒和包裹。切、采的病料放于密封的容器内。
（2）血清学检查 Ascoli反应是在病料腐败细菌培养失效时，或动物皮张、风干、腌浸过的肉品，仍可进行诊断的简便而快速的方法，其实验步骤如下。
①病料制成沉淀原。其制作方法有3种，即热浸出法、冷浸出法和氯仿处理法。
a.热浸出法。取被检病料（脏器、血液等）1～5克，在乳钵内研碎，加5～10倍的生理盐水，装入试管内煮沸20～30分钟，经石棉（或滤纸）过滤或离心沉淀，获得透明的淡黄色液体，作为沉淀原。
b.冷浸出法。取干皮（鲜皮先置37℃温箱烤干），经高压121℃30分钟灭菌后，再烤干，用剪刀剪成微细的碎块，称重后加入5～10倍的0.3%苯酚（石炭酸）生理盐水，置室温下浸泡18～24小时，用石棉或滤纸过滤，获得透明的液体，作为沉淀原。(www.xing528.com)
c.氯仿处理法。若被检材料含有脂肪，不宜获得透明滤液，可将被检材料剪碎研磨后，加入适量的氯仿处理5～6小时后将氯仿倒出，再加入生理盐水浸泡2～3小时，浸出液过滤，可获得透明的液体，作为沉淀原。
②沉淀素血清。由生物制品厂提供。
③操作程序与结果判定
a.重叠法。取沉淀反应管一支，用毛细管吸取炭疽沉淀素血清0.3～0.5毫升加入沉淀反应管内，另用一毛细吸管吸取制备的沉淀原0.2～0.4毫升，沿试管壁小心的加在沉淀素血清之上。注意避免产生气泡，两液接触面整齐，经3分钟（若检测皮张需15分钟）判定结果。在两液接触面出现一清晰白色沉淀环者为阳性反应；两液间无白色沉淀环者为阴性反应。如两液接触面出现模糊不清、疑是白色沉淀环时，应重新进行操作。
b.逆叠法。用毛细吸管吸取0.2～0.4毫升沉淀原加入反应管内，用另一支毛细吸管吸取炭疽沉淀素血清0.3～0.5毫升，插入管底，徐徐放入血清，将沉淀原浮起，重积在血清之上（因血清密度较大），约3分钟判定结果。判定方法同上。
c.在进行上述反应时，要设下列3组对照。
ⅰ.阳性对照：标准炭疽沉淀原＋炭疽沉淀素血清。
ⅱ.阴性对照：标准炭疽沉淀原＋健康羊血清。
ⅲ.生理盐水＋标准炭疽沉淀原。
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