羊病病毒分离培养方法及诊断措施

30.羊病诊断中常用的病毒分离培养方法有哪些？

因病毒不能在一般培养基中生长，只能在活的细胞内才能进行复制，所以病毒的分离培养常采用鸡胚分离培养法、细胞分离培养法及动物接种法。

（1）鸡胚分离培养法　是将能在鸡胚中生长的病毒接种在适宜的鸡胚（胚龄为9～12天）中进行培养的方法。鸡胚是一个适于多种病毒生长繁殖的细胞系统，在病毒的培养上具有重要的应用价值。鸡胚的接种途径主要有绒毛尿囊膜、尿囊腔、羊膜腔、卵黄囊接种等几种。

①绒毛尿囊膜接种。方法是选取孵育9～12天的鸡胚，照蛋（使用照蛋灯），划出气室及胚胎界线，用碘酊及酒精棉球消毒，于气室边缘附近将蛋壳开一小窗（半径约0.3厘米）。左手持鸡胚，使小窗面向操作者，右手持注射器用针头将气室边缘的壳膜挑起，刺一个小孔，缓缓注入0.05～0.2毫升接种物，使接种物渗入壳膜与绒毛尿囊膜之间，然后用玻璃纸或胶布覆盖蛋窗，也可以用融化的蜡封盖蛋窗，直立孵育。接种后应每天照蛋1次，以观察鸡胚存活情况。凡在接种后48小时内发生死亡者剔除，原因是死亡的鸡胚多系机械损伤、细菌或霉菌污染、过量接种物的刺激等非特异性因素所引起。观察时应保持绒毛尿囊膜接种创面朝上，以便集中收获感染的绒毛尿囊膜部位。将48～96小时死亡的鸡胚置于4℃冰箱中4小时或过夜，以免解剖时流血。解剖时在超净工作台内，先用碘酊棉球消毒气室部位，用无菌镊子除去气室部蛋壳及壳膜，然后用镊子夹起绒毛尿囊膜观察病变。用消毒小剪刀沿气室周围将接种的绒毛尿囊膜全部剪下，收获。将鸡胚及卵黄倒入经消毒的平皿，剪断卵带，再将贴附在卵壳上的绒毛尿囊膜撕下，一并收获保存。

②尿囊腔接种。如上选取鸡胚、划出气室，在鸡胚附近距气室2～3厘米处避开血管划出接种部位，常规消毒，钻两个小孔，一孔注入接种物0.1～0.2毫升，一孔用于排气（以减少鸡胚内压），两孔均以石蜡封口，置孵化箱内继续孵化。每天照蛋2次，弃去24小时内死亡者。收集36～72小时内死亡鸡胚，直立于蛋盘上置4℃冰箱中4小时或过夜，以免解剖时流血。解剖时在超净工作台内，先用碘酊棉球消毒气室部位蛋壳，再用无菌小镊子轻轻除去覆盖于尿囊膜上的壳膜，然后再用消毒小剪刀将绒毛尿囊膜剪一破口，用灭菌注射器或吸管吸取尿囊液。此步操作应注意避开血管且不刺破卵黄囊，最好用眼科镊子将胚胎压下再吸取。收获的尿囊液贮存于无菌小瓶内低温保存，并同时做无菌检查。(www.xing528.com)

③卵黄囊接种。选用5～8天的鸡胚，照蛋、划出气室和胚位，直立于蛋盘上，常规消毒划出部位，于气室中心的蛋壳上钻一小孔（最好不损伤壳膜），注射针通过该孔，沿胚的纵轴深入3厘米，注射接种物0.2～0.5毫升，然后用玻璃胶纸或胶布封闭壳孔，最后用溶化的石蜡封严，置孵化箱内继续孵化。每天照蛋、翻蛋2～4次，弃去24小时内死亡者。收集36～72小时内死亡鸡胚，直立于蛋盘上置4℃冰箱中4小时或过夜，以免解剖时流血。解剖时在超净工作台内，先用碘酊棉球消毒气室部位蛋壳，再用无菌小镊子除去，然后再用另一把无菌镊子撕破绒毛尿囊膜或羊膜，夹起鸡胚，切断卵黄蒂，将卵黄与绒毛尿囊膜分开，用消毒小剪刀将卵黄膜剪破，用生理盐水冲去卵黄，将囊膜置于无菌小瓶中低温保存。胚胎中也含有大量病毒，故可将胚胎一同收集。

④羊膜腔接种。选取10～14天的鸡胚，照蛋、划出气室和胚胎部位并消毒，在气室靠近胚胎侧的蛋壳上开一长方形口（约为10毫米×6毫米），注意勿损伤壳膜，用镊子除去此长方形蛋壳和外层壳膜，滴入1滴无菌液体石蜡，壳膜即透明，于照蛋灯下即可清楚观察到胚胎的结构。将注射针头刺入胚胎的颚下胸前，以针头拨动下颚及腿，当进入羊膜腔时，能看到鸡胚随着针头的拨动而活动，即可注入0.1～0.2毫升接种物。用一小块胶布封口，直立于蛋盘上，置孵化箱中继续孵育，注意不要翻动。每天检查1次，弃去24小时内死亡者。通常于接种后48～96小时即可收获。其方法基本同尿囊腔接种。吸取尿囊液后，再用小镊子轻轻夹起羊膜，用一无菌注射器或毛细管插入羊膜腔吸取羊水，低温保存，并做无菌试验。一般每个鸡胚可收获0.1～1毫升羊水。

（2）细胞培养法　用于细胞培养法的细胞培养类型有原代细胞、二倍体细胞或传代细胞系3种。原代细胞是由动物组织经胰蛋白酶消化、分散，获得单个细胞，再生长于培养皿中而制成，常用无特定病原菌动物（SPF）的肾和睾丸制备。原代细胞一般对病毒较易感，尤其是来源于胚胎或幼畜组织的细胞。二倍体细胞是将原代细胞消化分散成单个细胞，继续培养，其细胞染色体数与原代细胞一样，仍为二倍体。从样本中分离培养病毒，一般采用二倍体细胞。传代细胞系，这类细胞在体外可无限制分裂，亦可无限制传代，传代和培养方便，故使用广泛，其常用的有HeLa（人子宫癌细胞）、Vero（非洲绿猴肾细胞）、BHK-21（乳仓鼠肾细胞）、PK-15（猪肾细胞）等。据待分离培养病毒的种类先选择合适的细胞培养类型，然后进行培养。常用细胞培养的方法有静置培养和旋转培养，据需要进行选择。经过一定时间培养后，观察细胞产生的变化进行判定。由于感染所引起的细胞的变化（损伤）称之为细胞病变（CPE）。细胞病变的表现形式有细胞折光力增强、细胞聚集成丛、细胞融合成多核的巨细胞（形成合胞体）、胞浆中有空泡4种，在光学显微镜下即可观察到。

（3）动物培养法　首先选择对待检病毒有易感性并健康无病的实验动物，然后根据病毒的特性确定适当的接种途径，以无菌方法进行接种。接种后观察实验动物的发病情况、病理变化和血清中的抗体水平，据此进行诊断。