猕猴桃多酚氧化酶活性测定结果

实验5－2　猕猴桃多酚氧化酶活性的测定

一、基本原理

多酚氧化酶（polyphenoloxidase，PPO）是一种以铜为辅基的酶，能催化多种简单酚类物质氧化形成醌类化合物，醌类化合物进一步聚合形成呈褐色、棕色或黑色的聚合物。在猕猴桃后熟衰老过程或在采后的贮藏加工过程中，猕猴桃出现的组织褐变与组织中的多酚氧化酶活性密切相关。

多酚氧化酶催化邻苯二酚氧化形成的产物在420 nm处有最大吸收峰。因此，可利用比色法测定多酚氧化酶的活性。

二、仪器及试剂

（一）仪器及用具

研钵、高速冷冻离心机、分光光度计、计时器、移液器、离心管、试管、容量瓶（100 ml、1000 ml）。

（二）试剂

1．提取缓冲液（含1 mmol/L EDT A，1% Triton X－100和5% PVP）

称取37．2 mg EDTA、5 g PVP，取1 ml Triton X－100，加入到100 mmo1/L、p H 7．0磷酸缓冲液中，溶解定容至100 ml，混匀。

2．50 mmol/L邻苯二酚溶液

称取275 mg邻苯二酚，用0．1 mol、p H 5．5乙酸—乙酸钠缓冲液溶解、稀释至50 ml。

三、实验步骤(www.xing528.com)

（一）酶液制备

称取3．0 g猕猴桃样品，置于研钵中，加入5．0 ml提取缓冲液，在冰浴条件下研磨成匀浆。于4℃、12 000 r/min离心30 min，收集上清液即为酶提取液，低温保存备用。

（二）活性测定

取一支试管，加入4．0 ml 50 mmol/L、p H 7．0磷酸缓冲液和1．0 ml 50 mmol/L邻苯二酚溶液，最后加入100μl酶提取液，同时立即开始计时。将反应混合液倒入比色杯中，置于分光光度计样品室中。以蒸馏水为参比，在反应15 s时开始记录反应体系在波长420 nm处吸光度值，作为初始值，记录3 min OD变化，重复三次。

四、实验结果与计算

以每克猕猴桃样品（鲜重）每分钟吸光度变化值增加1为1个活性单位，单位是ΔOD ₄₂₀/（min·g）。计算公式：

U＝ΔOD ₄₂₀×V/V _s×m

式中：V——样品提取液总体积（ml）；

　　　V _s——测定时所取样品提取液体积（ml）；

　　　m——样品质量（g）。

多酚氧化酶活性还可以每分钟反应体系在波长420 nm处吸光度值变化增加1时所需的酶量为1个活性单位，单位是OD ₄₂₀/（min·mg）蛋白质。酶提取液中蛋白质含量可利用考马斯亮蓝染色法（实验3－4）进行测定。