猕猴桃过氧化物酶活性测定及采后生理贮藏

实验5－1　猕猴桃过氧化物酶活性的测定

一、基本原理

过氧化物酶（peroxidase，POD）是猕猴桃体内普遍存在的一种重要的氧化还原酶，它与猕猴桃的许多生理过程和生化代谢过程都有密切关系。在猕猴桃的生长发育、成熟衰老过程、抗病、抗氧化、抗逆境胁迫中，过氧化物酶活性不断发生变化。在受到外界刺激、病原菌侵染、贮藏环境变化、加工条件改变等作用时，猕猴桃组织中过氧化物酶活性都会做出相应的应答反应。

过氧化物酶催化过氧化氢（H ₂ O₂）氧化酚类物质产生醌类化合物。这些化合物进一步缩合，或与其它分子缩合形成颜色较深的化合物。在过氧化物酶催化作用下，过氧化氢能将愈创木酚（邻甲氧基苯酚）氧化形成4-邻甲氧基苯酚。该产物呈红棕色，在470 nm处有最大光吸收，故可通过比色法测定过氧化物酶的活性。

二、仪器及试剂

（一）仪器及用具

研钵、高速冷冻离心机、分光光度计、秒表、移液器、离心管、试管、容量瓶（50 ml、100 ml、1000 ml）。

（二）试剂

1．提取缓冲液（含1 mmol/L EDT A，1% Triton X－100和5% PVP）

称取37．2 mg EDT A、5 g PVP，取1 ml Triton X－100，加入到100 mmo1/L、p H 7．0磷酸缓冲液中，溶解定容至100 ml，混匀。

2．反应缓冲液

50 mmo1/L、p H 7．0磷酸缓冲液（含10 mmol/L H ₂ O₂，10 mmol/L愈创木酚），H ₂ O₂启动反应。(www.xing528.com)

三、实验步骤

（一）酶液制备

称取3．0 g猕猴桃样品，置于研钵中，加入5．0 ml提取缓冲液，在冰浴条件下研磨成匀浆，于4℃、12 000 r/min离心30 min，收集上清液即为酶提取液，低温保存备用。

（二）活性测定

取一支试管，0．3 ml酶提取液，加入2．7 ml反应缓冲液，再加入0．1 ml 100 mmol/L H ₂ O₂溶液迅速混合启动反应，同时立即开始计时。将反应混合液倒入比色杯中，置于分光光度计样品室中。以蒸馏水为参比，在反应15 s时开始记录反应体系在波长470 nm处吸光度值，作为初始值，记录3 min OD变化，重复三次。

四、实验结果与计算

U［μmol/（g·s）］＝（ΔOD ₄₇₀×V）/（V _s×m×26．8×60）

式中：V——样品提取液总体积（ml）；

　　　V _s——测定时所取样品提取液体积（ml）；

　　　m——样品质量（g）。