猕猴桃脂氧合酶活性检测及生理保鲜

实验4－5　猕猴桃脂氧合酶活性的测定

一、基本原理

脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）是一种含非血红索铁的蛋白质，专一催化具有顺、顺-1，4-戊二烯结构的多元不饱和脂肪酸的加氧反应，生成具有共轭双键的过氧化物。脂氧合酶在植物中普遍存在，其作用的底物主要为来自细胞质膜的多元不饱和脂肪酸，如亚油酸、甲基亚油酸、亚麻酸及花生四烯酸等。脂氧合酶与猕猴桃细胞脂质的过氧化作用、后熟衰老过程的启动和逆境胁迫、伤诱导、病原侵染信号的产生和识别等关系密切，被认为是引起猕猴桃后熟衰老的一类重要的酶。

脂氧合酶能催化含有顺、顺-1，4-戊二烯结构的多不饱和脂肪酸的加合氧分子反应，生成的初期产物具有共轭二烯结构，产物中的共轭双键在波长234 nm处具有特征吸收。因此，利用分光光度计法可以测定脂氧合酶活性大小。

二、仪器及试剂

（一）仪器及用具

研钵、高速冷冻离心机、移液器、离心管、紫外分光光度计、容量瓶（100 ml、1000 ml）、试管、计时器。

（二）试剂

1．亚油酸钠溶液

称取亚油酸钠（Sigma产品），直接配制0．1 mol/L亚油酸钠溶液。

2．0．1 mol/L、p H 6．8磷酸钠缓冲液

3．提取缓冲液（含1% Triton X－100和4% PVPP）

取1 ml Triton X－100和4 g PVPP，加入到100 ml 0．1 mol/L、p H 7．0磷酸缓冲液中，摇匀，置于4℃冰箱预冷。(www.xing528.com)

4．0．1 mol/L、p H 5．5乙酸—乙酸钠缓冲液。

三、实验步骤

（一）酶液提取

称取3．0 g猕猴桃组织置于研钵内，加入5．0 ml经4℃预冷的提取缓冲液，在冰浴条件下研磨匀浆，然后转入离心管于4℃、12 000 r/min离心30 min，收集上清液用于脂氧合酶活性测定。

（二）活性测定

取2．75 ml 0．1 mol/L、p H 5．5乙酸—乙酸钠缓冲液，加入50μl 0．1 mol/L亚油酸钠溶液，在30℃保温10 min，加入200μl粗酶液，混匀。以蒸馏水为参比调零，在反应15 s时开始记录反应体系在波长234 nm处吸光度值，为初始值，记录3 min OD变化。重复三次。

四、实验结果与计算

以每克猕猴桃样品（鲜重）每分钟吸光度变化值增加0．01为1个脂氧合酶活性单位，单位是0．01ΔOD ₂₃₄/（min·g m _F）。计算公式：

U＝（ΔOD ₂₃₄×V）/（0．01×V _s×m）

式中：V——样品提取液总体积（ml）；

　　　V _s——测定时所取样品提取藏体积（ml）；

　　　m——样品质量（g）。