ACC合成酶活性测定结果

实验4－3　ACC合成酶活性的测定

一、基本原理

ACC合成酶（ACC）能催化S-腺苷蛋氨酸（SA M）形成1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）。通过测定ACC催化形成的ACC的量，就可以反映ACC合成酶活性。

二、仪器及试剂

（一）仪器及用具

研钵、高速冷冻离心机、移液器、水浴锅、旋涡混合仪、旋转蒸发仪、样品瓶（20 ml，带有密封橡胶塞）、离心管、气相色谱仪。

（二）试剂

1．0．1 mol/L、p H 8．0磷酸钾缓冲液

2．提取缓冲液（含1 mmol/L EDTA、1 mmol/L PMSF、4 mmol/L DTT、3% PVPP和10μmol/L磷酸吡哆醛）。

称取24．7 mg磷酸吡哆醛（Mr＝247．1），溶解，用100 mmol/L、p H 8．0磷酸钾缓冲液定容至100 ml，混匀，即为1 mmol/L磷酸吡哆醛溶液。

称取29．2 mg乙二胺四乙酸（EDTA）、17．4 mg苯甲基磺酰氟（PMSF）、61．7 mg二硫苏糖醇（DTT）和3 g聚乙烯吡咯烷酮（PVPP），取1 ml 1 mmol/L磷酸吡哆醛溶液，加入到0．1 mol/L、p H8．0磷酸钾缓冲液中，定容至100 ml，混匀，即为提取缓冲液。

3．500 mmol/L、p H 8．0 HEPES—KOH缓冲液

称取4．77 mg N-（乙-羟乙基）哌嗪-N- a-乙烷磺酸（H EPES，M W＝238．31），溶于16 ml蒸馏水中，用2 mol/L KOH溶液调节p H至8．0，再稀释至20 ml，过滤后分装，4℃保存，即为1 mol/L H EPES—KOH储备液。

取5．0 ml 1 mol/L HEPES—KOH储备液。用蒸馏水稀释至100 ml，混匀，即为50 mmol/L、p H 8．0 HEPES—KOH缓冲液。

4．反应缓冲液（含250μmol/L SAM和10μmol/L磷酸吡哆醛）

称取1．0 mg S－腺苷蛋氨酸（SA M，MW＝399．4），0．1 ml 1 mmol/L磷酸吡哆醛溶液，用50 mmol/L、p H 8．0 HEPES—KOH缓冲液溶解，定容至10 ml，即得反应缓冲液。

5．5% NaClO－饱和NaOH混合液（V _NaClO∶V _NaOH＝2∶1）

6．25 mmol/L HgCl₂溶液(www.xing528.com)

称取67．88 mg HgCl₂，用蒸馏水溶解，稀释至10 ml。

三、实验步骤

（一）酶液提取

称取5．0 g果肉组织，加入5．0 ml提取缓冲液，在冰浴条件下研磨匀浆后于4℃、12 000 r/min离心30 min，收集上清液即为酶提取液。

（二）活性测定

将0．5 ml酶提取液和1．5 ml反应缓冲液加入到20 ml样品瓶中，用橡胶塞密封样品瓶后，在30℃水浴中保温1 h。然后注射加入0．1 ml 25 mmol/L HgCl₂溶液以终止反应，并置于冰浴10 min平衡温度，再用注射器加入0．2 ml经冰浴预冷的5% NaClO-饱和Na0H混合液（V _NaClO∶V _NaOH＝2∶1），迅速振荡5 s后，放回冰浴平衡5 min，顶空取1．0 ml气体测定乙烯释放量。重复三次。

四、实验结果与计算

根据气相色谱法测得顶空气体中乙烯含量，以乙烯的产生速率表示每小时每克猕猴桃样品组织（鲜重）中ACC合成酶活性，即为nmol/（h·g）。

ACS活性　［nmol/（h·g）］＝（c×V _L×V）/（R×V _s×t×m×22．4）

式中：c——气谱法测得样品气体中乙烯含量（μl/L）；

　　　V _L——样品瓶剩余空间体积（ml）；

　　　V——样品提取液总体积（ml）；

　　　R——ACC向乙烯转变的效率（%）；

　　　V _s——测定时所取样品提取液体积（ml）；

　　　t——酶促反应保温时间（h）；

　　　m——样品质量（g）；

22．4——标准状况下1 mol气体体积常数（L/mol）。