一、基本原理
猕猴桃组织在受到高温或低温胁迫时，组织中游离脯氨酸含量会明显升高。在逆境胁迫下，猕猴桃的抗逆性与组织游离脯氨酸的积累程度有关。游离脯氨酸亲水性极强，可以防止细胞水分散失，还能稳定原生质胶体及组织内的代谢过程，降低冰点，从而增强低温胁迫下猕猴桃组织的抗寒性。因此，游离脯氨酸含量可作为一个重要的生理指标，在一定程度上反映了猕猴桃组织对不良环境胁迫的抵抗能力。
利用磺基水杨酸提取猕猴桃组织中的游离脯氨酸，在酸性条件下经加热处理后，能与茚三酮反应生成稳定的红色缩合物。用甲苯萃取色素，色素的深浅程度与脯氨酸含量的高低有关。该红色缩合物在波长520 nm处有最大吸收峰，且在一定范围内吸光度值的大小与脯氨酸浓度的高低成正比。因此，通过比色的方法可测定猕猴桃组织中游离脯氨酸的含量。
二、仪器及试剂
（一）仪器及用具
分光光度计、研钵、烧杯、容量瓶（100 ml、250 ml）、具塞刻度试管（25 ml）、移液器、水浴锅、离心机。
（二）试剂
1．酸性茚三酮溶液
2．5%酸性茚三酮溶液（以3∶2的冰醋酸和6 mol/L磷酸为溶剂进行配置），此液在4℃下2～3 d有效。
2．3%磺基水杨酸水溶液
称取3 g磺基水杨酸，加100 ml蒸馏水溶解。
3．乙酸（冰醋酸）
4．甲苯
5．脯氨酸标准溶液
准确称取25 mg脯氨酸，用蒸馏水溶解后定容至250 ml，其浓度为100μg/ml。再取10 ml该溶液，用蒸馏水稀释至100 ml，即为10μg/ml的脯氨酸标准液。
6．6 mol/L磷酸。(www.xing528.com)
三、实验步骤
（一）标准曲线的制作
取7支具塞刻度试管按表10加入试剂，混匀后加盖，在沸水中加热60 min，取出冷却后，向各管加入5 ml甲苯，充分振荡，萃取出红色物质，静止后分离，以0号管为空白，在520 nm下测定吸光度值。绘制标准工作曲线，求得线性回归方程式。
表10 绘制脯氨酸标准曲线各试剂加入量
（二）提取
称取2．0 g猕猴桃样品，置于研钵中，加入2．0 ml 3%磺基水杨酸溶液，研磨匀浆后，转入到试管中，再用3．0 ml 3%磺基水杨酸溶液冲洗研钵，一并转入试管中。将试管置于沸水浴中煮沸提取10 min（提取过程中要经常摇动）。取出冷却后于10 000 r/min离心15 min，收集上清液即为脯氨酸提取液。
（三）测定
吸取上清液2 ml，加入2 ml冰醋酸，2 ml的水，4ml酸性茚三酮试剂，置沸水浴中60 min。冷却后加入5 ml甲苯，充分振荡，萃取红色物质，静置后分离，在520 nm处测定吸光度值。从标准曲线中查相应的浓度。
四、实验结果与计算
根据显色液的吸光度值，从标准曲线上查出显色液中相应的脯氨酸的质量，计算猕猴桃组织样品中脯氨酸含量，以μg/g表示。计算公式：
脯氨酸（μg/g）＝（c×V）/（W×A）
式中：c——标准曲线中查出的相应浓度，相当于提取液中脯氨酸的μg/2 ml含量；
V——提取液的总体积（ml）；
A——测定所用的体积（ml）；
W——样品重（g）。
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