一、基本原理
考马斯亮蓝G－250（Coomassie brilliantblue G－250）法是利用蛋白质—染料结合的原理，定量测定微量蛋白质浓度的方法。该染料在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大吸光在465 nm，后者在595 nm。在一定的蛋白质浓度范围（1～1000μg）内，蛋白质与该染料结合物在595 nm波长下的吸光度值与蛋白质含量成正比，符合比尔定律，故可用于蛋白质的定量测定。
考马斯亮蓝G－250与蛋白质结合反应十分迅速，2 min左右即达到平衡。其结合物在室温下1 h内保持稳定。该反应快速灵敏、易于操作、干扰物质少（考马斯亮蓝G－250和蛋白质通过范德华力结合，受蛋白质的特异性影响较小，除组蛋白外，其他不同种类蛋白质染色强度差异不大），可测定微克级蛋白质含量，是一种比较好的蛋白质定量法。但此方法也存在缺点，考马斯亮蓝在蛋白质含量很高时线性关系偏低，且不同来源蛋白质与染料结合状况有差异。
二、仪器及试剂
（一）仪器及用具
离心机、分光光度计、移液器、研钵、离心管、旋涡混合器、烧杯、容量瓶（1000 ml、100 ml）、具塞刻度试管（20 ml）。
（二）试剂
1．标准蛋白质溶液（100μg/ml牛血清蛋白质）
称取25 mg牛血清蛋白质，加入蒸馏水溶解并定容至100 ml。吸取上述溶液40 ml，用蒸馏水稀释至100 ml即可。
2．考马斯亮蓝G－250溶液
称取100 mg考马斯亮蓝G－250，溶于50 ml 90%乙醇溶液中，再加入100 ml 85%的磷酸，混合摇溶。将混合液转移到1000 ml容量瓶中，加入蒸馏水稀释、定容至刻度。贮于棕色瓶中，常温下可保存1个月。如有沉淀，可过滤后使用。
三、实验步骤
（一）制作标准曲线
取6支具塞试管，编号，并按表8加入标准蛋白质溶液和蒸馏水，混匀后，向各试管中加入5．0 ml考马斯亮蓝G－250溶液。每加完一支试管，立即在旋涡混合器上混合（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。混合后静置2 min后，以0号试管为空白对照，在595 nm下比色测定吸光值。以蛋白质质量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，求得线性回归方程。
表8 考马斯亮蓝法测定可溶性蛋白质含量绘制标准曲线的各试剂加入量(www.xing528.com)
（二）提取
取3．0 g左右的果肉，加入7 ml 4℃下预冷的提取介质（100 mmol/L磷酸缓冲液，p H 7．0，内含5%的PVP，1 mmol/L EDT A和1% Triton X－100）冰浴下匀浆，于4℃下12 000 r/min离心20 min，上清液为可溶性蛋白粗提液，低温保存备用。
（三）测定
吸取1．0 ml样品提取上清液（视蛋白质含量适当稀释），放入具塞试管中，加入5．0 ml考马斯亮蓝G－250溶液，充分混合，放置2 min后在波长595 nm处比色，按照制作标准曲线同样的方法测定吸光度值。重复三次。
四、实验结果与计算
1．测定数据记录（格式见表9）
表9 测定数据记录表
2．计算结果
根据溶液吸光度值，在标准曲线上查出相应的蛋白质质量，计算猕猴桃中可溶性蛋白质含量，以每克猕猴桃组织（鲜重）所含可溶性蛋白质的质量表示，即mg/g。计算公式：
可溶性蛋白质含量＝（m′×V）/（V s×m×1000）（mg/g）
式中：m′——从标准曲线查得的蛋白质的质量（μg）；
V——样品提取液总体积（ml）；
V s——测定时所取样品提取液体积（ml）；
m——样品质量（g）。
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