实验2－3 猕猴桃可溶性糖含量的测定
一、基本原理
糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糖醛或羟甲基糖醛，生成的糖醛或羟甲基糖醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糖醛衍生物。在一定范围内，该衍生物颜色的深浅与糖的含量成正比。糖类与蒽酮反应生成的有色物质在可见光区波长630 nm处具有强的吸收峰。
使用该方法可以测定几乎所有的碳水化合物。不但可以测定戊糖（如木糖、核糖和阿拉伯糖）与己糖（如葡萄糖、果糖、山梨糖、半乳糖）、蔗糖、糖原、多缩葡萄糖，而且还可以测定所有寡糖类和多糖，其中包括淀粉、纤维素等（反应液中的浓硫酸可以把多糖水解成单糖而发生反应）。所以，用蒽酮法测出的碳水化合物含量，实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。在没有必要细致划分各种碳水化合物的情况下，用蒽酮法可以一次测出总量，省去许多麻烦，因此，有特殊的应用价值。此外，不同的糖类与蒽酮试剂的显色深度不同，果糖显色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖显色较浅，五碳糖（戊糖）显色更浅。因此，测定糖的混合物时，常因不同糖类的比例不同造成误差，但测定单一糖类时，则可避免此种误差。
二、仪器及试剂
（一）仪器及用具
分光光度计、水浴锅、刻度试管（25 ml）、移液管（10 ml）、研钵、容量瓶（100 ml）、滤纸、漏斗、玻璃棒等。
（二）试剂
1．蒽酮—硫酸试剂
100 mg蒽酮溶于100 ml稀硫酸（76 ml浓硫酸加24 ml蒸馏水中）。
2．浓硫酸（相对密度1．84 mg/ml）
3．100μg/ml葡萄糖标准液。
三、实验步骤
（一）标准曲线的制作
取6支25 ml刻度试管（重复做两组），编号，按表6加入100μg/ml葡萄糖标准液和蒸馏水。然后按顺序向试管中加入0．5 ml蒽酮—硫酸试剂和5．0 ml浓硫酸，充分振荡，立即将试管放入沸水浴中，逐管准确保温1 min，取出后自然冷却至室温。以0号管作空白对照调零，在波长625 nm处测定吸光度（OD）值。以吸光度值为纵坐标，葡萄糖的质量为横坐标，绘制标准曲线，并求出线性回归方程。
表6 蒽酮试剂法测定可溶性糖绘制葡萄糖标准曲线的试剂量(www.xing528.com)
（二）可溶性糖的提取
称取1．0 g猕猴桃组织置于研钵中，研磨呈浆状后，倒入10 ml刻度离心管内，加4 ml 80%酒精，置于80℃水浴中不断搅拌40 min，离心，收集上清夜，其残渣加2 ml 80%酒精重复提2次，合并上清液。在上清液中加10 mg活性炭，80℃脱色30 min，过滤后取滤液，定容至10 ml。
（三）显色测定
吸取上述可溶性总糖提取液1 ml，加入5 ml蒽酮试剂混合，沸水浴煮10 min，取出冷却。在625 nm处测OD值。从标准曲线上得到提取液中糖的含量。
四、实验结果与计算
（一）测定数据记录（格式见表7）
表7 测定数据记录表
（二）计算结果
根据显色液吸光度值，在标准曲线上查出相应的葡萄糖质量，按下式计算猕猴桃组织中可溶性糖含量，以质量分数（%）表示。计算公式：
可溶性糖含量＝（m′×V×N）/（V s×m×106）×100%
式中：m′——从标准曲线查得的葡萄糖质量（μg）；
V——样品提取液总体积（ml）；
N——样品提取液稀释倍数；
V s——测定时所取样品提取液体积（ml）；
m——样品质量（g）。
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