免疫球蛋白提取过程及方法

二、免疫球蛋白的提取

1．饱和硫酸铵的制备方法：

将500ml蒸馏水加热至70℃～80℃，然后将400g化学纯或试剂级硫酸铵粉末溶解其中，搅拌使其充分溶解并趁热过滤，去除不溶解物质，待其冷却至室温，在容器底部有硫酸铵结晶析出，上清液即为饱和液，此时的pH偏酸，应用前以28%氨水调至pH为6．5～7．0即可。

2．抗体球蛋白的提取过程：

3．脱盐：

常用透析法或凝胶过滤方法。

（1）透析法：将蛋白液移入玻璃纸透析袋中浸入冷磷酸盐缓冲液中（pH8．0），搅拌透析2小时后，置冰箱中继续透析12～18小时，每隔2～4小时更换一次透析液，每次换液时，取透析液3ml～4ml，并向其中加入奈氏试剂（碘化汞115g，碘化钾80g，蒸馏水500ml，20%氢氧化钠500ml）1～2滴，若有铵离子存在，则出现黄色反应或砖红色反应，若无铵离子则无此反应。当连续三次每一小时的透析液中皆无铵离子时，即可停止透析。

（2）凝胶过滤法：球蛋白脱盐，常采用葡聚糖G25或G50凝胶柱过滤的方法。葡聚糖是右旋糖酐和氧氯丙烷缩合而成，不溶于水、碱及弱酸，是一种具有网状结构的球形颗粒，吸水后，网眼张开，其网眼大小依型号而不同。这种凝胶颗粒装成柱，它就具有分子筛和层析的作用，当蛋白液通过凝胶柱时，盐类和一些小分子物质可通过网眼进入凝胶球内，而蛋白分子较大，不能进入网眼内，则顺着凝胶球流下，在洗脱液不断冲洗情况下，大分子的蛋白质首先下来，而其它小分子的盐类等仍停留在柱子内，达到蛋白质的纯化和脱盐作用。凝胶过滤的方法是：

①装柱：过滤前首先装柱，即将蒸馏水泡涨的葡聚糖凝胶（浸泡约12小时）并以0．01mol／L、pH7．4的磷酸盐缓冲液（PB）平衡了的凝胶悬液，倾入直径约2．5cm特制的玻璃管（也可以用碱式滴定管代用）内，管底事先铺上双层纱布或玻璃纤维，最好将凝胶一次倾入管内，这样装成的柱子不会有分层或气泡、裂缝等。同时要求柱子垂直，柱子上表面要平，柱子的高度要求为直径的10倍以上。一般柱子装好后可以立即使用。

②胶滤：剪一圆形滤纸片置于胶柱上表面，打开开关让液体流出，当胶柱上端缓冲液正好全部进入柱内时，用毛细滴管吸取蛋白液沿管壁仔细加于胶柱表面（勿将胶柱表面冲打起）。待样品完全进柱后，继续沿管壁仔细加入上述缓冲液，控制流速，并保持柱顶一定深度的液层，待蛋白出现时，开始收集直到无蛋白反应为止。第一阶段收集液体为除去硫酸铵的蛋白液，后洗出液体为空白液或含有SO－4和NH－4的缓冲液。测试蛋白可用20%的磺酸水杨酸溶液在玻璃板上滴定，或用紫外分光光度计测定。

③再生：葡聚糖凝胶用后经再生仍可使用，其方法是将用过的凝胶倾入烧杯中，用蒸馏水多次漂洗，至奈氏剂检查为阴性时（不出现黄色反应）为止，再按以下次序漂洗：0．5mol／L氢氧化钠、蒸馏水、0．1mol／L盐酸（倒进即刻倾出）、蒸馏水、0．5mol／L氢氧化钠、蒸馏水、缓冲液，最后加入0．01%硫柳汞作为防腐剂，置冰箱内备用。

4．蛋白定性

蛋白液脱盐后，用醋酸纤维薄膜电泳进行定性，电泳后薄膜上的蛋白分布在γ区。薄膜电泳的方法从略。

进行荧光标记的蛋白液，必须将白蛋白除去干净，否则会给以后的荧光抗

体染色带来非特异性。

5．蛋白定量

可用弗林法进行，方法如下：（1）试剂：(www.xing528.com)

甲液：2%NaCO₃稀释于0．1M氢氧化钠中。

乙液：0．5%CuSO₄·5H₂O在1%酒石酸钠溶液中。

丙液：甲液50ml＋乙液1ml（临用时配）。

丁液：Fo1in酚试剂：

　　　　　　　　　钨酸钠（Na₂WO₄·2H₂O）　　50g

　　　　　　　　　钼酸钠（Na₂MOO₄·2H₂O）　　12．5g

　　　　　　　　　蒸馏水　　　　　　　　　　　　　350ml

　　　　　　　　　85%磷酸　　　　　　　　　　　　 25ml

　　　　　　　　　浓盐酸　　　　　　　　　　　　　50ml

以上试药在500ml烧瓶中混匀，装上冷凝管，加若干小磁片，微火回流10小时，至呈金黄色时，加入硫酸锂75g、水25ml、溴水数滴，煮沸15分钟，除去多余溴，最后加水至500ml。

（2）制定标准曲线：称取白蛋白加入5M氢氧化钠溶液中使其溶解，再加蒸馏水依次分别稀释为50μg／ml、100μg／ml、200μg／ml、300μg／ml、400μg／ml、500μg／ml，加入试剂丙和试剂丁后，在650nm波长下，测出每一浓度的O．D值，划出蛋白量与O．D值每对数值的座标点，并求出标准曲线。

（3）蛋白含量的测定：

①取出纯球蛋白的透析物0．1ml，分别用pH8．0PBS稀释成不同溶液，一般为1∶50、1∶100、1∶200（每个稀释度做2管），为样品，每管1ml，对照管仅加pH8．0PBS1ml。样品管和对照管分别加入试剂丙5ml、试剂丁0．5ml，摇匀后置37℃中水浴30分钟，中间再振荡1～2次，以免Fo1in酚试剂沉于管底。

②取出后用72型分光光度计，在650nm波长下比色，测出不同浓度蛋白管的O．D值。

③以各读数查标准曲线表，求出标本中蛋白的含量（Xμg／ml）。

④将Xμg／ml乘上标本的稀释倍数，再除以1000，即为每毫升标本中所含蛋白的毫克数。