离子交换法提取谷氨酸：生物制药技术实训

一、任务介绍

在模拟仿真生产环境下完成离子交换法提取谷氨酸的操作。要求：

1.熟练利用离子交换法提取谷氨酸，能根据谷氨酸的性质选择合适的树脂和提取条件。

2.按照标准操作规程，能熟练操作和维护自动液相色谱分离层析仪。

3.学会柱层析的一般工艺流程。

二、任务分析

氨基酸是两性电解质，谷氨酸的等电点为3.22。当pH≤3.22时，谷氨酸以阳离子状态存在，因此可以用阳离子交换树脂来提取。

三、相关知识

离子交换层析是用离子交换剂作固定相，利用它与流动相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合物的层析方法。带电荷量少、亲和力小的先被洗脱下来，带电荷量多、亲和力大的，后被洗脱下来。

按活性功能基团带电荷性质不同，离子交换剂分为阳离子、阴离子交换剂。离子交换法可以用来分离多肽蛋白、氨基酸、核酸及其他带电的生物分子。

四、任务需要的材料

1.树脂　732型苯乙烯强酸性阳离子交换树脂。

2.原料　发酵液上清。

3.仪器设备　自动液相色谱分离层析仪（包括恒流泵、梯度混合器、层析柱、数控自动部分收集器、紫外检测仪、仪器车、电脑及工作站软件），移液管，分光光度计，秒表，恒温水浴锅，酸度仪，纯化水。

4.试剂　1mol/L盐酸溶液；1mol/L氢氧化钠溶液；4%～4.5%氢氧化钠溶液；pH2.2缓冲液；茚三酮显色剂。

五、任务实施

（一）操作前准备

1.提取操作人员按《洁净区人员更衣规程》进行更衣。

2.检查操作间、配料间是否有清场合格标志，并在有效期内。否则按清场标准操作规程进行清场并经QA人员检查合格后，填写清场合格证，才能进行下一步操作。将“清场合格证”附入批生产记录。

3.检查设备是否有“合格”、“已清洁”标牌，并对设备进行检查，确认设备正常，挂运行状态标志，方可使用；检查主要仪器、仪表是否经过校验，并在有效期内。否则应更换合格仪器、仪表。

4.根据“批生产指令”填写领料单，到预处理部门领取发酵液上清，到物料部门领取物料。

5.挂运行状态标志，进入操作。

（二）生产操作

1.试剂配制

茚三酮试剂：2g水合茚三酮溶于95%乙醇中，加水至100ml。

pH2.2缓冲液：钠离子0.20mol/L，柠檬酸21g，氢氧化钠8.4g，盐酸16ml，加水至1L。可用50%氢氧化钠或浓盐酸调pH　2.2。

1mol/L盐酸溶液；1mol/L氢氧化钠溶液。

2.树脂的预处理和转型　选择合适的层析柱，根据层析柱规格估计床体积，计算干树脂的用量。取所需量树脂后加蒸馏水充分溶胀，溶胀后倾倒去除溶胀时流出的杂质及碎小树脂。加入1mol/L　HCl浸泡4小时，用蒸馏水洗涤至中性。加1mol/L　NaOH至上述树脂中浸泡4小时，倾弃碱液，用蒸馏水洗涤至中性。

3.装柱和平衡　按照溶液的流动方向将恒流泵和层析柱进行安装，并校正恒流泵的流速，控制流速在30滴/分钟之内。

湿法装柱：关闭层析柱底部出口，柱内加入一定量蒸馏水，自顶部注入经处理的上述树脂悬浮液，关闭层柱出口，待树脂沉降后，放出过量的溶液，再加入一些树脂，至树脂沉积至所需高度即可。记录床体积，维持树脂上层一定高度液体为2～3cm。

柱子平衡：用4倍床体积的2mol/L　HCl洗涤，保持流速10～12滴/分钟（1滴/秒），至流出液pH为0.5。然后，用水（约10倍床体积）冲洗，至流出液pH为1.5～2.0关闭柱子出口，保持液面高出树脂表面1cm左右。

4.上样(www.xing528.com)

样品处理：为了取得好的回收效果，将发酵液pH调整为1.5～1.7。

上样：由于湿树脂的谷氨酸实际交换量为60g/1000ml，可根据实际床体积计算上柱体积。打开出口使液体流出，待液面几乎平齐树脂表面时关闭出口（不可使树脂表面干燥，操作不熟练的同学为了防止上层树脂浮动可以维持0.5～1cm高度的液位进行加样操作）。用长滴管将样品仔细直接加到树脂顶部，打开出口使其缓慢流入柱内，以30滴/分钟的流速。用茚三酮显色法测定流出液中的氨基酸，若流出液中无氨基酸则继续上样，若流出液中含有氨基酸则可视为加样结束。

5.自动液相色谱分离层析仪的安装和调试　按照《自动液相色谱分离层析仪操作规程》，以蠕动泵→层析柱→检测器→收集器的顺序连接设备。将蠕动泵的软管入口连接到待洗涤溶液，将蠕动泵的出口软管连接到层析柱的上端，层析柱的下端连接检测器。检测器下端为进口，上端为出口。将检测器出口连接到自动收集器的入口。

根据谷氨酸的性质，将检测器背面进行选择波长的操作（在四个波长中选择合适的波长）。

将检测器的背面记录仪接口与工作站的接口连接，注意正极（红色）与正极相连，负极（黑色）与负极相连，并注意记录接入的通道数字1或者2。检测器另一端连接电脑主机背面。检测器选择“2A”吸光度和灵敏度模式，进行调零（调到0或者0.010～0.005）。

6.洗柱　连接洗涤液，启动蠕动泵，用2倍床体积pH　2.2缓冲液洗涤。流出液用废液缸收集。

7.洗脱　连接4%～4.5%氢氧化钠洗脱液。设定收集器的收集模式（计滴或者计时）、首管和末管，换上与收集模式对应的收集头。确认模式后，调整收集头位置，保证溶液滴出口在收集试管的正中间。

打开电脑桌面的工作站软件，选择通道（与前面记录通道数字一致），录入工作内容信息、方法等内容后，按检测器“START”开始进行洗脱和收集工作，在软件上选择数据收集开始收集数据。根据检测器的检测值，记录有数字显示的试管数或时间。

8.样品检测和收集　根据曲线记录，取部分管中溶液0.2ml，加入0.2ml茚三酮显色剂。结合检测结果和洗脱曲线，并合并含有氨基酸的各管，得到洗脱液。合并洗脱液即为提取液，取样1ml用前述茚三酮法测定谷氨酸含量。其他提取液正确计量后于0～4℃贮存。填写记录，附入批生产记录。

9.树脂处理和保存　按《离子交换树脂操作规程》进行树脂的再生处理，并选择合适的方法保存树脂。

10.自动液相色谱分离层析仪的维护　按照《自动液相色谱分离层析仪操作规程》冲洗仪器各通道，尤其注意清洗检测器的吸收池。将收集器的试管进行清洗、干燥。

（三）生产结束

1.按《提取间清场操作规程》对仪器、房间进行清洁消毒。

2.填写批生产记录，并签字。

3.填写清场记录，经QA检查员检查合格，并签发“清场合格证”。

（四）标准操作规程

1.离子交换提取岗位标准操作规程。

2.提取间清场操作规程。

3.分光光度计操作规程。

4.离子交换树脂保存操作规程。

5.自动液相色谱分离层析仪操作规程。

六、归纳总结

（一）生产工艺管理要点

1.菌种操作室洁净度按万级洁净度要求，操作区洁净度达百级。

2.在装柱时必须防止气泡、分层及柱子液面在树脂表面以下等现象发生。整个过程中一直保持流速在10～12滴/分，并注意勿使树脂表面干燥。

（二）质量控制关键点

1.上样终点、洗脱终点的判断。

2.上样pH、洗脱pH要按照规定控制，否则会影响吸附和洗脱过程的效率。

七、拓展提高

离子交换树脂的再生方法。