一、任务介绍
在模拟仿真生产环境下完成谷氨酸发酵生产及发酵产物检测工作。要求：
1.熟悉工业上生产氨基酸的方法。
2.学会初级代谢产物谷氨酸发酵过程监测。
3.能进行本产品生产所用的仪器仪表使用、保养以及处理常见的故障。
二、任务分析
谷氨酸发酵是典型的代谢控制发酵，使用菌种集中在棒状杆菌和短杆菌属，它们都是生物素缺陷型。发酵过程中，通过控制生物素亚适量或添加吐温60或青霉素等，调节细胞膜渗透性，使细胞内生成的谷氨酸分泌到发酵液中。生物素是催化脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰CoA羧化酶的辅酶，参与脂肪酸的合成，进而影响磷脂的合成。谷氨酸发酵中控制生物素亚适量即生物素初浓度为5～10mg/L。发酵初期，菌体正常生长，当生物素耗尽菌体再次繁殖时，形成磷脂合成不足的不完全的细胞膜，菌体伸长、膨大，完成谷氨酸非积累型细胞向谷氨酸积累型细胞的转变，细胞产生的谷氨酸分泌到细胞外。
三、相关知识点
代谢控制发酵原理，谷氨酸发酵过程中过程控制的一般方法。
1.物理参数 温度、压力、体积（V）、空气流量、搅拌转速等。
2.化学参数 pH、溶氧。
3.生物参数 菌体浓度、生物基质浓度、代谢产物浓度等。
（1）菌体浓度：取样，离心沉降，称湿重或细胞干重、比浊法、活菌计数等。
（2）生物基质浓度、代谢产物浓度：一般采用酶法分析、化学分析或色谱法。
四、任务需要的材料
1.菌种 谷氨酸棒杆菌。
2.发酵培养基配方 葡萄糖2.5%；尿素0.34%；磷酸氢二钾0.16%；玉米浆2.0%；硫酸镁0.043%；pH7.0、115℃灭菌15～20分钟。
五、任务实施
（一）操作前准备
1.操作人员按《生产区人员更衣规程》进行更衣。
2.检查发酵工作操作间是否有清场合格标志，并在有效期内。否则按清场标准操作规程进行清场并经QA人员检查合格后，填写清场合格证，才能进行下一步操作。将“清场合格证”附入批生产记录。
3.检查设备是否有“合格”、“已清洁”标牌，并对设备进行检查，确认设备正常方可使用。
4.根据“批生产指令”填写领料单，到菌种部门领取菌种。
5.挂运行状态标志，进入操作。
（二）生产操作
1.发酵前准备工作。
2.发酵罐实消 按照《发酵罐操作规程》进行。
3.发酵操作 按照《发酵罐操作规程》进行。
（1）接种：将20ml种子培养液接种于装有2 000ml酵培养基的5L发酵罐中。
发酵前期（前12小时），发酵温度控制在33～34℃，pH 7.2，每4小时测定一次菌体浓度和残糖，发酵12小时后测定培养液pH，若pH低于7.0，流加25%（g/100ml）尿素，以控制发酵pH；
发酵中期（12～36小时），pH控制如前期，每8小时测定一次菌体密度和残糖，发酵温度控制在35～36℃；
发酵后期（36～48小时），pH控制在7.0，每8小时测定一次菌体密度和残糖，发酵温度控制在37～38℃。
（2）补料：补料时在火焰保护下插针，需加酸时禁止采用HCl（对不锈钢有腐蚀性）。
（3）取样：用取样插针，用罐压压出。插针插入后，打开通气，关闭尾气。
（4）放料：放料前，务必先要关闭温度和转速，确认面板显示“OFF”。
4.清洗 按照《发酵罐操作规程》进行。
5.关机 在关闭电源前，确认温度和转速处于“OFF”状态。电源关闭后，及时关闭冷却水。发酵罐在不使用的情况下，一般保持一定体积的清水。(www.xing528.com)
（三）生产结束
1.发酵结束后，关闭设备所有开关，关闭总电源。
2.填写《发酵生产批报（发酵罐）》。
3.按《发酵间清场操作规程》对设备、房间进行清洁消毒。
4.填写清场记录，经QA检查员检查合格，在批生产记录上签字，并签发“清场合格证”。
（四）标准操作规程
1.发酵岗位标准操作规程。
2.发酵罐标准操作规程。
3.发酵间清场操作规程。
六、归纳总结
（一）生产工艺管理要点
1.能按照GMP规范组织生产，协调各工序的工作，组织生产，质量控制。
2.以发酵时间为横坐标，OD600、湿重和残糖量为纵坐标，绘制发酵曲线。
3.确定该菌株发酵谷氨酸的主要影响因素及其较优发酵条件。
4.明确影响谷氨酸发酵生产的因素有哪些，如何对其进行调控。
（二）质量控制关键点
能进行与本车间相关的质量要点控制。
七、拓展提高
1.能对本产品生产过程中的较重大事故隐患提出处理意见，并采取有效措施减少对生产的影响。
2.具有应对事故的处理能力。
3.能起草标准操作规程。
【附】
一、生物量的测定
原理：生物量的测定方法有比浊法和直接称重法等。由于细菌菌体在液体深层通气发酵过程中是以均一混浊液的状态存在的，所以可以采用直接比色法进行测定。
方法：取发酵液进行适当稀释，在600nm下进行比色。
二、还原糖的测定（DNS比色法）
原理：3，5-二硝基水杨酸（简称DNS），在碱性条件下，还原糖与DNS共热，DNS被还原为3-氨基-5-硝基水杨酸（棕红色物质），还原糖则被氧化成糖酸及其他物质。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度呈一定的比例关系，可在752型分光光度计540nm波长测定棕红色物质的吸光度值。查标准曲线计算，可求出发酵液中还原糖的含量。
标准曲线的制作：取9支干燥试管，编号，按表2-1所示的量，精确浓度为1.00mg/ml的葡萄糖标准液和3，5-二硝基水杨酸试剂。
表2-1 还原糖标准曲线制作
将各管摇匀，戴上小漏斗，在沸水浴中加热5分钟，立即用冷水冷却至室温，再向各管中加入蒸馏水20.0ml，用橡皮塞塞住管口，颠倒混匀。切勿用力振摇，引入气泡。在540nm波长下，以0号管为空白，在分光光度计上测定1～8号管的吸光度值。以吸光度值为纵坐标，葡萄糖毫克数为横坐标，绘制标准曲线。
发酵液中残留还原糖的测定：发酵液单层滤纸过滤，滤液0.2ml定容至100ml，稀释至含糖量2～8mg/100ml为试样。
取4支干燥试管，编号，按表2-2所示的量，精确加入待测液和试剂。
表2-2 还原糖的测定
加完试剂后，其余操作步骤与制作葡萄糖标准曲线时的相同，测定出各管溶液的吸光度值。
计算：以管1、2、3的吸光度值的平均值在标准曲线上查出相应的还原糖毫克数，并计算样品中还原糖的百分含量。
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