谷氨酸生产菌种的制备：生物制药技术实训

一、任务介绍

在模拟仿真生产环境下完成谷氨酸菌种的制备。要求：

1.熟悉发酵工业菌种的复壮工艺和质量控制。

2.完成谷氨酸菌种的制备。

3.按照超净工作台操作规程，在局部洁净区进行菌种的制备。

二、任务分析

谷氨酸棒杆菌在合适的培养基中经摇瓶培养能快速生长，得到大量健壮的种子。谷氨酸棒杆菌生长速度较快，接种量一般在1%～2%。发酵工业生产过程中种子必须满足以下条件：

1.菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长，迟缓期短。

2.生理形状稳定。

3.菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求。

4.无杂菌污染。

5.保持稳定的生产能力。

三、相关知识点

菌种制备的主要手段是扩培，其出发点就是尽可能地培养出高活性、能满足大规模发酵需要的纯种。菌种扩培的顺序是：斜面菌种、一级种子、二级种子。

四、任务需要的材料

1.菌种　谷氨酸棒杆菌。

2.仪器设备　试管、三角瓶、高压灭菌锅、摇床、培养箱、显微镜、分光光度计、超净工作台等。

五、任务实施

（一）操作前准备

1.制种操作人员按《洁净区人员更衣规程》进行更衣。

2.检查操作间是否有清场合格标志，并在有效期内。否则按清场标准操作规程进行清场，并经QA人员检查合格后，填写清场合格证，才能进行下一步操作。将“清场合格证”附入批生产记录。

3.打开超净工作台的紫外线和鼓风机，灭菌30分钟，挂运行状态标志。

4.检查生化培养箱和摇床是否有“合格”、“已清洁”标牌，并对设备进行检查，确认设备正常，挂运行状态标志，方可使用。

5.根据“批生产指令”填写领料单，到菌种部门领取菌种。

（二）生产操作

1.斜面种子的制备

（1）配制斜面培养基，加热溶解后分装到已灭菌的空试管中，装量为1/4～1/5，0.1MPa灭菌30分钟放斜面。

斜面培养基配方：葡萄糖0.1%，蛋白胨1.0%，牛肉膏1.0%，氯化钠0.5%，琼脂2.0%～2.5%，pH　7.0～7.2。

（2）斜面在37℃空培24小时，检查无菌后备用。

（3）将原种上的菌苔划线接种到新制斜面上，32℃培养24小时，制成斜面菌种。(www.xing528.com)

2.一级种子培养　一级种子的培养目的在于制备大量高活性的菌体。

培养基配方如下：葡萄糖2.5%，尿素0.5%，硫酸镁0.04%，磷酸氢二钾0.1%，玉米浆2.5%～3.5%（按质增减），硫酸亚铁2mg/L、硫酸锰2mg/L，pH7.0。

1000ml三角瓶中装200ml培养基，8层纱布封口，0.1MPa灭菌30分钟，冷却后接种，接种量为一支斜面接一瓶。30～32℃摇床培养12小时，如用旋转式摇床，转速为170～190转/分。

一级种子质量标准：种龄：12小时；pH∶6.4＋0.1；ΔOD（660nm光密度净增值）＞0.5；RG（残糖）0.5%以下。

3.二级种子培养　二级种子的培养目的在于制备和发酵罐体积及培养条件相称的高活性菌体。

培养基配方：葡萄糖2.5%；尿素0.34%；磷酸氢二钾0.16%；糖蜜1.16%；硫酸镁0.043%；消泡剂0.086ml/L；pH7.0。

0.1MPa灭菌10～15分钟，冷却后接种，摇床培养7～8小时。

二级菌种质量标准：种龄7～8小时；pH7.2；ΔOD600＞0.5；无菌检查：阴性；噬菌体检查：阴性。

4.并种　将每5瓶二级菌种在无菌条件下合并在1000ml的抽滤瓶里（抽滤瓶先经0.1MPa灭菌30分钟），放入冰箱待用。

5.培养。

（三）生产结束

1.接种结束后，关闭设备所有开关，关闭总电源。

2.填写《生产菌种制备与移交记录——固体菌种》、《生产菌种制备与移交记录——液体菌种》。

3.按《菌种间清场操作规程》对设备、房间进行清洁消毒。

4.填写清场记录，经QA检查员检查合格，在批生产记录上签字，并签发“清场合格证”。

（四）标准操作规程

1.菌种岗位标准操作规程。

2.超净工作台标准操作规程。

3.菌种间清场操作规程。

六、归纳总结

（一）生产工艺管理要点

1.菌种操作室保持GMP要求的洁净度级别。

2.接种后放置生化培养箱或摇床培养。

3.接种过程应确保严格的无菌操作。

（二）质量控制关键点

无菌操作。

七、拓展提高

设备常见故障及排除方法。