一、任务介绍（任务描述）
在模拟仿真生产环境下完成培养基的配制和灭菌工作。要求：
1.能合理选用和制备谷氨酸棒杆菌生长所用的培养基。
2.了解配制培养基的原理，会配制培养基的一般方法和步骤。
3.按照标准操作规程，能安全操作高压灭菌锅，并进行日常维护。
4.按照标准操作规程，正确使用培养基制备中常用的仪器，如天平、加热设备、pH计等。
二、任务分析
培养基（Media）是适合微生物生长繁殖或累积代谢产物的营养基质。由于各类微生物对营养的要求不同，培养目的和检测需要不同，因而培养基的种类很多。无论何种培养基，都必须含有碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子和水，这些营养物按照一定的比例配方，在适合微生物生长繁殖的pH和温度下，经过灭菌后才可以使用。培养基的配制一般经过称量、溶化、调pH、分装、灭菌。
三、相关知识
培养基的营养成分及功能、类型和用途，培养基的选择和确定，培养基灭菌的方法。
四、任务需要的材料
（一）培养基配方
斜面培养基 葡萄糖0.1%，蛋白胨1.0%，牛肉膏1.0%，氯化钠0.5%，琼脂2.0%～2.5%，pH7.0～7.2（传代和保藏斜面不加葡萄糖）。
（二）试剂和仪器
1mol/L NaOH溶液，1mol/L HCl溶液，pH试纸，电子天平，药匙，称量纸，锥形瓶，烧杯，量筒，试管，无菌培养皿，玻璃棒，棉花，牛皮纸或报纸，封口膜，线绳，纱布，刻度移液管等。
五、任务实施
（一）操作前准备
1.培养基制备操作人员按《进入生产控制区更衣程序》进行更衣。
2.检查操作间是否有清场合格标志，并在有效期内，否则按清场标准操作规程进行清场并经QA人员检查合格后，填写清场合格证，才能进行下一步操作；将“清场合格证”附入批生产记录。
3.检查设备是否有“合格”、“已清洁”标牌，并对设备进行检查，确认设备正常，方可使用。
4.挂运行状态标志，进入操作。
（二）生产操作
1.培养基的配制
（1）称量：按照批生产记录和培养基的配方，计算称量的量，准确称取各成分。
（2）溶化：在烧杯中加入适量的水（按需要可为蒸馏水或自来水，水量略少于要配制的培养基的量）加热，然后依次加入各组分（琼脂暂时不加），使其溶解（加热过程中应不断搅拌以免糊底），待完全溶解后补足水量。
（3）调节pH：初制备好的培养基往往不能符合所要求的pH，如培养基偏酸或偏碱时，可用1mol/L NaOH或1mol/L HCl溶液进行调节。调节pH时，应逐滴加入NaOH或HCl溶液，防止局部过酸或过碱，破坏培养基中成分。边加边搅拌，并不时用pH计或试纸测试，直至达到所需pH为止。
（4）配制固体培养基：将已配好的液体培养基加热煮沸，将称好的琼脂（1.5%～2.0%）加入，并用玻璃棒不断搅拌，以免糊底烧焦。继续加热至琼脂全部融化，最后补足因蒸发而失去的水分。
2.培养基的分装 将制好的培养基分别分装入试管，瓶口塞上棉塞（或硅胶泡沫塞），用牛皮纸包扎管（瓶）口。分装时注意不要使培养基玷污管口，以免造成污染。如操作不小心，培养基玷污管口时，可用镊子夹一小块脱脂棉，擦去管口的培养基，并将脱脂棉弃去。
分装入试管的培养基量，如用作保存菌种用的斜面，分装高度以试管高度的1/4～1/5为宜。如用作平板，用的大试管则装12～15ml左右。半固体培养基分装试管一般以管高度1/3为宜，灭菌后制成斜面或垂直待凝成半固体深层琼脂。
3.培养基的灭菌 培养基经分装包扎后，应立即进行高压蒸汽灭菌，0.1MPa灭菌20分钟。如培养基中含葡萄糖，则无菌条件为0.075MPa灭菌20～30分钟。如因特殊情况不能及时灭菌，则应暂存于冰箱中。
（1）需灭菌的物品（分装在试管、三角烧瓶中的固、液体培养基）用防潮纸包好（防止锅内水汽把棉塞淋湿），放入灭菌锅内。
（2）将灭菌锅盖的蒸汽管插入套筒侧壁的凹槽内，关闭灭菌锅盖，旋紧螺栓，切勿漏气。(www.xing528.com)
（3）打开放气阀，加热，热蒸汽上升，以排除锅内冷空气，排气5～10分钟，关闭放气阀。
（4）关闭放气阀后，整个灭菌锅成为密闭状态，而蒸汽又不断增多，这时压力和温度都上升，当温度升至121℃，保持20～30分钟即达到灭菌目的。
（5）灭菌完毕，待压力自然降至“0”时，打开放气阀。注意不能打开过早，否则突然降压致使培养基冲腾，使棉塞、硅胶泡沫塞沾污，甚至冲出容器以外。
（6）打开灭菌锅盖，取出已灭菌的器皿及培养基。
4.斜面和平板的制作
（1）斜面的制作：将已灭菌装有琼脂培养基的试管，趁热置于木棒上，使成适当斜度，凝固后即成斜面（图2-2）。斜面长度不超过试管长度1/2为宜。如制作半固体或固体深层培养基时，灭菌后则应垂直放置至冷凝。
（2）平板的制作：将装在锥形瓶或试管中已灭菌的琼脂培养基融化后，待冷至50℃左右倾入无菌培养皿中。温度过高时，皿盖上的冷凝水太多；温度低于50℃，培养基易于凝固而无法制作平板。平板的制作应在火焰旁进行，左手拿培养皿，右手拿锥形瓶的底部或试管，左手同时用小指和手掌将棉塞打开，灼烧瓶口，用左手大拇指将培养皿打开一缝至瓶口正好伸入，倾入10～12ml的培养基（图2-3）。迅速盖好皿盖，置于桌上，轻轻旋转平皿，使培养基均匀分布于整个平皿中，冷凝后即成平板。
图2-2 斜面的放置
图2-3 将培养基倒入培养皿内
5.培养基的无菌检查 灭菌后的培养基，一般需进行无菌检查。最好从中取出1～2管（瓶），置于37℃恒温箱中培养1～2天，确定无菌后方可使用。
（三）生产结束
1.按《称量间清场操作规程》和《配制间清场操作规程》对仪器、房间进行清洁消毒。
2.填写批生产记录，并签字。
3.填写清场记录，经QA检查员检查合格，并签发“清场合格证”。
（四）标准操作规程
1.培养基配制岗位标准操作规程。
2.pH计操作、维护规程。
3.高压蒸气灭菌锅标准操作规程。
4.子天平操作程序规程。
5.锁传递柜（门）操作规程。
6.量间清场操作规程。
7.制间清场操作规程。
六、任务归纳总结
（一）生产工艺管理要点
1.称量间、配制间保持GMP要求的洁净度级别。
2.正确配制培养基。
（二）质量控制关键点
培养基的无菌检查。
七、任务的拓展提高
设备常见故障及排除方法。
免责声明：以上内容源自网络，版权归原作者所有，如有侵犯您的原创版权请告知，我们将尽快删除相关内容。
