糖苷酶研究：生淀粉酶分离与提纯

在该项目完成后，糖苷酶的研究一直持续到新世纪，品种不断增加，从对酶的结构与功能的研究，延伸到基因工程，在为生产服务方面，还进行了水解生淀粉的淀粉酶研究，等等。现分述如下：

（一）α－淀粉酶

枯草杆菌BF－7658α－淀粉酶是在1950年代筛选到的一个很有应用价值，并在生产中发挥了重要作用的酶制剂品种，张树政领导的研究室对该酶进行了提纯和性质的研究。经提纯为凝胶电泳呈现两条带后，分别测定了它们的等电点和分子量等。

（二）葡萄糖淀粉酶

红曲产葡萄糖淀粉酶已在前面详细叙述。此外，糖化酶还可广泛用于高果糖浆、其他饮料酒、食醋、抗生素、维生素、有机酸等的生产，仍有很大的发展潜力。

（三）生淀粉酶

传统的以淀粉为原料酿酒和生产酒精的工艺，必须经过将生淀粉糊化的蒸煮工序，才能用淀粉酶分解成单糖，再进行酒精发酵。这道工序不仅劳动强度大，且大量耗费能源，因此寻找可以降解未经糊化而直接将生淀粉水解成单糖的酶，对于酒精生产具有重要意义。张树政领导的糖苷酶研究组对生淀粉酶产生菌进行了分离和筛选，又对分解生淀粉的黑曲霉突变株产生的葡萄糖淀粉酶进行了提纯和一般性质的研究，研究了该酶的化学组成及其光谱学性质和底物特异性，又对局限青霉生淀粉水解酶的产生条件及酶一般性质进行了研究。

（四）β－淀粉酶

何秉旺等在张树政指导下，从事微生物β－淀粉酶的研究，他们对从多粘芽孢杆菌β－淀粉酶的生产及酶性质进行了研究。后来又以蜡状芽孢杆菌AS1．447为出发菌，经过各种理化因子的反复诱变，得到高产菌株M－3。酶活力由原来的74 U／ml提高到5 000～7 000U／ml，而当时日本报道的酶活力仅3 600 U／ml。其水解产物主要是麦芽糖，仅少量麦芽三糖，1982年7月在无锡通过鉴定。β－淀粉酶用于代替部分大麦芽生产啤酒，在北京啤酒厂中试取得成功，1986年10月通过鉴定。

（五）麦芽四糖淀粉酶和异麦芽三糖水解酶

从1980年代后期到1990年代前期，张树政研究组对热稳定的形成麦芽寡糖的淀粉酶进行过较详细的研究，他们在国内首先从产碱菌属细菌中发现了分解产物是麦芽四糖的麦芽四糖淀粉酶，提纯了该酶并研究了它的性质、化学修饰、底物特异性，及其水解淀粉的特性，还着重研究了产碱菌麦芽四糖淀粉酶多型性的形成。该菌酶解淀粉后的寡糖中，麦芽四糖可达90%左右，说明这种酶可用于制造高纯度的有重要经济价值的麦芽四糖，该酶还可以水解各种来源的淀粉及含淀粉的原料，包括野生植物的淀粉，又不是致病菌，有可观的工业应用前景。

（六）异淀粉酶

异淀粉酶，不同来源的异淀粉酶作用专一性不同。产气克氏杆菌产生的此酶能完全分解茁霉多糖的α－1，6键生成麦芽三糖，故也叫茁霉多糖酶，但不能作用于糖元；假单胞菌的异淀粉酶则能分解糖元，而不能分解茁霉多糖。在中国首先由江西食品发酵工业科学研究所（原轻工部食品发酵研究所）研究，该酶可使支链淀粉变为直链淀粉制备食品包装薄膜，并可与β－淀粉酶配合生产麦芽糖以及用于啤酒外加酶糖化。张树政领导的糖化酶组利用该所王惠莲教授赠送的菌种及其酶制剂，进行了茁霉多糖酶的提纯及性质的研究。用制备式聚丙烯酰胺凝胶电泳获得了凝胶电泳均一的酶。测定了它们的性质和功能，此酶为糖蛋白，含有半乳糖、葡萄糖、甘露糖、鼠李糖和阿拉伯糖等，纯化的酶能专一地水解茁霉多糖、糯米淀粉、糊精，不作用于糖原、纤维二糖及环状糊精。

（七）纤维素酶和β－葡萄糖苷酶

微生物研究所参加了1968年由国家组织的纤维素酶攻关大协作组，从采土样、分离、筛选、鉴定菌种开始。北京菌种筛选小分队共获得37个属的10 780株菌，从中筛选纤维素酶（34属2 907株）及半纤维素酶（32属2 650株）和果胶酶（28属1 899株）的生产菌株。纤维素酶以木霉属活力最高，半纤维素酶以曲霉属活力最高，果胶酶以青霉属活力最高。从1972年起，张树政担任了微生物研究所酶学研究室的副主任，该室的纤维素酶组获得了康氏木霉的白色变异株（Trichoderma Koningi）AS3．4290和AS3．4001，并利用它水解糠醛渣生产酵母。研究了酶的形成和酶解糠醛渣的条件，在适宜条件下糖浓度可达4．5%。进一步用糠醛渣酶解液来培养酵母菌假丝酵母等可作饲料的菌体蛋白质，菌体产率对投入糖计可达50%～60%，酵母菌蛋白质含量达40%～50%，核酸提取量是酵母的4%～6%。但该项成果由于成本较高而未能推广。该纤维素酶组也进行了液体纤维素酶酶解木屑的试验。该组还由腐殖土中分离到一株腐质霉，研究了该菌的产酶条件和酶的性质，发现该菌的纤维素酶有较高的最适温度和热稳定性，适用于在较高温下分解纤维素，在大港油田进行过水化油井压裂液羧甲基纤维素钠胨胶的试验。后来他们又获得了康氏木霉纤维素酶高产突变株。

在应用的基础上，他们又进行了纤维素酶的分离纯化及酶性质的研究。由康氏木霉中纯化了纤维素酶C1组分。测定分子量，确定了其可催化微晶纤维素、磷酸膨胀纤维素和脱脂棉，降解产物主要是纤维二糖。随后又确定该酶为糖蛋白，仅由一条肽链组成。含糖约7%，主要有甘露糖、半乳糖、葡萄糖及氨基葡萄糖。又将Cx酶的分子型分离纯化并比较其性质，然后，将这些康氏木霉的纤维素酶系进行一系列分离纯化，获得6个聚丙烯酰胺凝胶电泳均一的组分。他们用电镜细胞化学法证实Cx酶位于菌丝细胞壁的表面，较易脱落；有时发现位于质膜与细胞壁之间。

他们又对黑曲霉的一葡萄糖苷酶进行了纯化和性质研究。发现其β－D－葡萄糖苷酶在经凝胶电泳时呈单一带，分子量为770 000，该酶不仅能水解纤维二糖和对硝基苯－β－D－葡萄糖苷，还能微弱水解对硝基苯－β－D－半乳糖苷和－β－D－木糖苷。对其分子中活性中心的研究显示色氨酸残基对－β－D－葡萄糖苷酶的活力是非常重要的。他们又从103株青霉和21株拟青霉中筛选了β－葡萄糖苷酶生产菌。初筛出8株活力较高的菌株，进行了酶性质的比较。发现8株菌还同时存在α－半乳糖苷酶、β－半乳糖苷酶、β－N－乙酰氨基葡萄糖苷酶、β－N－乙酰氨基半乳糖苷酶及β－木糖苷酶等。绳状青霉和桧状青霉有微量β－N－甘露糖苷酶。

（八）果胶酶

果胶酶用于果汁果酒澄清，是重要的微生物酶制剂。张树政领导的酶室对果胶酶的研究从1980年代开始，他们曾选出高产果胶酶的黑曲霉菌种AS3．316。对其培养条件和最适产酶条件进行了研究，还解决了许多应用中遇到的问题，例如除去粗酶制剂中的花色素酶，维持果汁的色泽等。果胶酶研究组还首创了酶法莲子脱内皮的新工艺。1980年代先后在江西广昌县试验，通过了技术鉴定，在江西石城县及福建泰宁县等地推广应用，取得了重大经济效益和社会效益。张树政兼职的河北省科学院微生物所也采用固体培养法生产过果胶酶，用于葡萄、苹果、草莓等果汁及果酒的澄清，效果显著。在原定计划中提出的5年内提高菌种活力，改造生产工艺，如由固体培养法改为液体培养、生产粉剂果胶酶等。另一方面推广其应用范围，并进行成果转让等指标，都圆满完成。1991年，“果胶酶菌种选育及酶的制备”课题，获中国科学院科技进步三等奖。

（九）α－半乳糖苷酶

α－半乳糖苷酶也称蜜二糖酶，用于甜菜糖中除去影响蔗糖结晶的棉子糖，增加蔗糖纯度。我国黑龙江省应用微生物研究所酶制剂组曾筛选出两株高活力的α－半乳糖苷酶生产菌，在甜菜糖制造中做过应用试验。张树政领导的糖苷酶研究组对分枝犁头霉产生的α－半乳糖苷酶进行了分离纯化及酶性质的研究。测定了它们的氨基酸组成和分子量，并证明该酶由4个亚基组成，并进一步研究了酶的动力学及化学修饰。查明色氨酸残基和羧基是酶反应所必需的。

（十）β－甘露聚糖酶(www.xing528.com)

β－D－甘露聚糖酶在食品、医药、造纸、纺织印染、石油开采及生物学研究上有广泛应用，用该酶水解甘露多糖所得到的甘露寡糖有较好的生理调节功能，是优良的食品添加剂。张树政领导的研究组诺卡氏菌形放线菌的β－D－甘露聚糖酶，有着良好的热稳定性和耐碱性，是研究蛋白质结构和功能的好材料。在对其提纯和性质研究基础上，进一步探讨了氨基酸残基的修饰与酶活性的关系，并结合荧光及圆二色性扫描光谱的分析，研究了该酶的结构与功能。

（十一）右旋糖酐酶

张树政领导的糖苷酶课题组从事过右旋糖酐酶优良菌株的筛选及酶性质的比较研究，从3 162株真菌中筛选出有活力的菌株528株，最后对5株菌产生的该酶进行了酶学性质的比较。特别是对焦曲霉产生的右旋糖酐酶进行了纯化，用制备凝胶电泳纯化得到了均一的制品。测定了该酶的分子量，并确定该酶只作用α－1，6－葡萄糖苷键，为内切型。又对淡紫拟青霉所含的右旋糖酐酶的形成条件进行过研究，发现这种诱导酶的最佳诱导物便是右旋糖酐，但分子量为1 000 KD的右旋糖酐诱导作用比分子量小的要强。

（十二）红曲霉α－葡萄糖苷酶（麦芽糖酶）

糖苷酶研究组从红色红曲霉中分离纯化了α－葡萄糖苷酶，并进行了该酶性质的研究。测定了分子量，得知其由两个亚基组成，两个酶分子型的催化性质基本相同。该酶对麦芽糖和麦芽三糖等低聚糖有较高的水解速度，对糊精及可溶性淀粉等高聚物的水解速度较低。这一点与葡萄糖淀粉酶恰好相反。在1980年代，国际上发展起来一种称为导向活性部位的抑制剂活性部位标记，或称亲和标记法，是研究酶结构与功能的先进技术。张树政研究组，发现的β－葡萄糖苷酶的导向活性中心的抑制剂Conduritol B epoxide也对红色红曲霉的α－葡萄糖苷酶有强烈抑制作用。于是利用这一手段研究了该酶的结构与功能，证明羧基位于酶的活性部位。

（十三）环状糊精葡糖基转移酶

环状糊精葡糖基转移酶是1984年研究所其他研究人员报道用于生产环状糊精的嗜碱细菌。1990年代后期，张树政研究组研究了该嗜极酶的酶学性质，发现其最适反应温度为65℃，在50℃以下稳定，根据化学修饰剂作用的试验，估计组氨酸和色氨酸残基为酶活性的必要基团。

（十四）海枣曲霉的糖苷酶类

张树政领导的糖苷酶研究组在海枣曲霉的麸曲培养物粗提液中测出了多种聚糖酶和糖苷酶活力。聚糖酶中以木聚糖酶活力最高，糖苷酶则有β－木糖苷酶、α－半乳糖苷酶、β－N－乙酰半乳糖胺酶、β－葡萄糖苷酶、β－D－岩藻糖苷酶等。据文献报道，称β－D－岩藻糖苷酶是β－半乳糖苷酶或β－葡萄糖苷酶的副作用。但张树政研究组则发现该菌株中β－D－岩藻糖苷酶活力则高于β－半乳糖酶活力，因而对这几个酶进行了提纯并探索了它们的性质，证明它们是独立的3个酶。同时又对活性很高的木聚糖酶及木糖苷酶进行了提纯和性质研究。他们纯化了3种不同的木聚糖酶，其中有一种是地衣多糖酶，兼具分解木聚糖的能力。他们对这7种酶进行了化学组成、化学修饰、圆二色光谱及荧光光谱等性质的研究，其结果曾在两次国际学术会议上报告。

张树政研究组由海枣曲霉中发现了高度专一的β－D－岩藻糖苷酶，这是在真菌中首次发现这种酶。其底物专一性远比文献报道的这种酶高，因此从海枣曲霉中发现的β－D－岩藻糖苷酶应作为该酶的代表。同时否定了文献中所说称β－D－岩藻糖苷酶是β－半乳糖苷酶或β－葡萄糖苷酶的副作用的观点。经过提纯研究，证明β－半乳糖苷酶和β－葡萄糖酶的性质各不同，它们各自均为独立的酶。随后，他们对海枣曲霉糖苷酶类的性质进行了深入研究，还确定了其产生的7种糖苷酶类分子中发生活性的必需基团。随后他们又对海枣曲霉中的β－木糖苷酶进行了提纯并研究了它的酶学性质，还对该曲霉的木聚糖酶进行了纯化，测定了该酶的末端序列，并探讨了该酶降解寡聚木糖的特性，深入研究了木聚糖酶HI糖组成及糖肽结合键，证明它是一种糖蛋白，经硅胶薄层层析和毛细管气相色谱测定，每分子酶约含4个葡萄糖和1个甘露糖残基。

（十五）酸性木聚糖酶

以将木聚糖酶用于纸浆生物漂白为目的，筛选了自己采集和分离的多株真菌产生酸性木聚糖酶活力，获得了酶活力较高，基本不产纤维素酶的菌株，对该菌的产酶条件进行了研究。然后对产木聚糖酶活力较高的黑曲霉中的该酶进行了提纯和性质研究，证明该酶为单聚体，经氨基酸组成分析，发现蛋白中有较高含量的甘氨酸和门冬氨酸。

（十六）几丁质酶

1980年代后期，张树政领导的实验室从1 121株真菌、细菌和放线菌中筛选到237株有β－N－乙酰氨基己糖苷酶活性的菌株，其中以溜曲霉中的该酶比活性最高，对它们进行了酶学性质及底物特异性等研究，发现它的酶活力稳定，糖基专一性强。较少受产物抑制，最适反应pH接近中性，外切型，可以水解HCG末端的GlcNAc。该酶的提纯制品曾提供给外单位使用，用于水解几丁质，据称其性能及专一性达到或超过sigma产品的水平。1990年代后期，他们又分别从康氏木霉和烟曲霉中找到产生几丁质酶的菌株，前者分解产物主要是几丁寡糖和少量氨基葡萄糖；后者的几丁质酶是细胞外酶，其作用有内切和外切两种形式，对其纯化后，研究了酶学性质，测定了分子量，还发现羧基和色氨酸是其活性的必要基团，有糖苷基转移酶活性。由于几丁寡糖有多种药效，因此他们进行了诱变育种以提高酶活力，有工业应用的前景。他们还筛选到可产生具有特别作用方式的新几丁酶。这些新获得的产几丁质酶的菌种，具有生产氨基葡萄糖等药物的应用前景，张树政的学生们一直在设法进行开发研究。

（十七）肝素酶

张树政领导的研究组从棒杆菌等菌株中筛选到产肝素酶的菌种，对其产生条件进行了研究，发现这是一种存在于细胞内的诱导酶。肝素酶具有多种重要用途，包括体外循环中肝素的消除，肝素精确结构的确定，肝素抗凝血机理及肝素结构与功能的研究，制备低分子量肝素及抗肿瘤药物，肝素酶本身可抑制新血管生成及碱性成纤维细胞生长因子介导的血管内皮细胞的增殖等，而肝素除用作血液抗凝剂外，还具有抗炎症、抗肿瘤和抗病毒等作用。此前国外商品化的肝素酶均由肝素黄杆菌产生，价格非常昂贵。张树政研究组的报道，是国内的首次。此后，他们又从鞘胺醇杆菌中筛选到产肝素酶的菌株。

（十八）其他糖苷酶

除对以上糖苷酶进行了较深入研究，并获得了一批成果，发表了15篇论文外，他们还测定了43株真菌（主要是曲霉和根霉）培养物的12种糖苷酶活性。同时筛选出产α－岩藻糖苷酶的青霉，并进行了酶生成条件的研究。

（十九）唾液酸

唾液酸是一族神经氨酸衍生物，广泛分布于动物组织和牛奶中，可以寡聚糖、糖蛋白和糖脂形式存在。在细胞的表面，唾液酸与细胞的粘连和识别等现象是密切相关的。同时，唾液酸及其衍生物在医药上也有重要的功能，它是一种止咳祛疾剂，对于中心和外周神经性疾病以及脱髓鞘病均有疗效。如唾液酸胆固醇可以治疗早老型痴呆症、唾液酸lewes在抗炎、抗肿瘤方面有很大用途。由于唾液酸在动物组织中的含量比较低，分离和提纯过程比较复杂，收率较低，难以实现大规模工业化生产。1957年有人首先在大肠杆菌中发现唾液酸的同聚合体多聚唾液酸，后来人们相继在其他菌株中发现多聚唾液酸，这为实现多聚唾液酸的微生物工业化生产提供了重要前提。张树政领导的研究组选出了大肠杆菌C－8，并试验了产多聚唾液酸的生理生化条件，选出高产菌株并最佳发酵生产条件。在新世纪中，通过张树政的学生们继续工作，生产唾液酸的技术已经成熟。