魔芋高产栽培及关键技术

(二)魔芋组培成苗的操作流程及关键技术环节

1.魔芋组培成苗的操作流程

魔芋组培快繁过程可概括如下:外植体的选择和消毒灭菌→在诱导培养基上诱导外植体产生愈伤组织并增殖→愈伤组织在继代分化培养基上培养，开始芽点分化，形成不定芽→切割不定芽，在生根培养基上进行根的分生生长→试管苗形成、移栽和管理。

(1)培养材料的选择和表面消毒。魔芋的许多组织，如球茎、根状茎、鳞片、花芽、叶芽等等均可作为培养材料。取样前外植体母株的选择很重要。母株必须具备品种的典型性状，品种纯度要高。由于魔芋是多年生、用种量大的无性繁殖作物，品种易发生混杂，为了获得高产、优质的后代，最好于头一年在田间对品种纯度和特性进行鉴定、标记，选定代表性强、健康无病的母株备用，第二年在室内培育母株，这样既可减少季节、天气影响，又便于消毒。如果条件不允许，也可直接取材于大田，但要特别注意将植株携带的泥土反复洗净，严格消毒、灭菌，否则会加重组培污染。

外植体的消毒是控制污染的前提。组培过程中常因消毒灭菌工作不彻底而导致污染严重，影响组培苗的生产成本。通常材料的表面消毒程序是先将材料洗净外部泥土，用自来水冲洗30～40分钟，再用杀菌剂处理2～10分钟，无菌水冲洗2～3遍，然后用灭菌纸将材料揩干水备用。常用的杀菌剂及使用方法见表1。

表1　几种主要杀菌剂的使用浓度

植物组织培养过程中常用的消毒剂是酒精、氯化汞、次氯酸钙、次氯酸钠，还有过氧化氢、硝酸银等。选择消毒剂既要考虑杀菌力，也要避免损害材料。70%～75%的酒精容易损伤材料，但具有较强的杀菌力、穿透力和湿润作用，可以排除材料上的空气，利于其他消毒剂的渗入，故用来与其他消毒剂配合使用。

我们用6种不同消毒方法，(方法1: 75%酒精浸泡1分钟→0.1%氯化汞浸泡10分钟→无菌水冲洗3次;方法2: 75%酒精浸泡1分钟→0.1%氯化汞浸泡15分钟→无菌水冲洗3次;方法3: 75%酒精浸泡1分钟→0.2%氯化汞浸泡10分钟→无菌水冲洗3次;方法4: 75%酒精浸泡1分钟→0.2%氯化汞浸泡15分钟→无菌水冲洗3次;方法5: 75%酒精浸泡1分钟→10%次氯酸钙浸泡25分钟→无菌水冲洗3次;方法6: 75%酒精浸泡1分钟→2%次氯酸钠浸泡25分钟→无菌水冲洗3次)，比较氯化汞、次氯酸钠、次氯酸钙等最常用的消毒剂的消毒效果，结果表明6种方法消毒效果差异不显著，操作规范时均能使初代接种污染率控制在5%以下;而且经过无菌水冲洗去掉残留后对材料的损伤较小。在几种消毒剂中氯化汞消毒时间最短也最经济，可以重复利用，但去掉残留较难，要仔细用无菌水冲洗，另外要注意使用安全，防止消毒液沾染到工作人员皮肤上。

组培中外植体带菌引起的污染与材料的选择关系密切。首先应选择健康无病的母株植株作外植体，以节省外植体消毒灭菌成本。若外植体内部带菌，则单纯采用酒精、氯化汞、次氯酸钠、次氯酸钙等消毒剂效果不理想。如果受材料限制必须使用带病球茎，则应与表面活性剂或润湿剂如吐温配合使用，或与抽气减压、磁力搅拌、超声振动等方法并用，使消毒剂能渗入到外植体内部，达到更好的消毒效果，同时可在培养基中加入适量的抗生素。此外，材料的预处理方法也很重要，外植体带菌引起的污染与材料的预处理也关系密切。例如在球茎消毒灭菌预处理过程中，消毒前仔细冲洗球茎(带皮)是必要的，而去掉表皮再消毒比不去皮可以显著地降低接种后真菌污染率。此外，由于魔芋葡甘露聚糖遇水溶胀，容易包裹病菌，造成消毒困难，因此去皮后的球茎在消毒前切勿接触水分。

植物材料的消毒是很重要的环节，但在植物组织培养中所出现的污染问题，往往不是由于最初的消毒不好造成的，而是操作不当引起的。因此接种操作必须规范，接种工作人员应经过严格培训才能上岗，切割用培养皿必须高温消毒，接种用刀剪、镊子应经常在酒精灯上灼烧，防止交叉感染;接种动作要轻缓，切忌手臂等从已灭菌的外植体、培养皿、培养基上经过。

(2)愈伤组织的诱导增殖。如前所述，魔芋组培快繁过程实质上是细胞脱分化及再分化过程，即愈伤组织的诱导、生长及再分化。在这一过程中既要求外植体细胞改变原有的发育进程，同时又要使其保持原始种的遗传特性。实现这一目标的手段是生育环境的调控，包括培养基组分的选择，环境pH的调节和温度、光照等培养条件的控制。其中培养基组分包括无机培养成分、有机营养和植物生长调节物质(激素)，通常用基本培养基加外源激素种类和浓度来表达。

植物组培快繁常用的基本培养基有MS培养基、B5培养基、SH培养基、white培养基。魔芋通常采用MS培养基。MS培养基最大的特点是营养成分齐全，含较高水平的盐浓度和较高的铵态氮，糖的种类是蔗糖，浓度30～40克/升，进行固体培养时添加6～8克/升的琼脂。MS培养基上添加不同组分和浓度配比的外源激素，就构成了愈伤组织诱导培养基、愈伤组织继代分化培养基和壮苗生根培养基。

在魔芋组培脱分化阶段，生长素是诱导魔芋脱分化、产生愈伤组织的必需条件。单独使用细胞分裂素，对愈伤组织诱导无效。魔芋组培物对环境pH有较强的缓冲能力，在脱分化过程中，pH6.0～6.5时，愈伤组织形成生长较好。魔芋组织培养适宜温度为23～27℃，37℃高温持续7天，对愈伤组织的生长和分化均无显著的影响，而且此组培物对环境温度的抗性显著增强。因此，可通过组培筛选耐热或耐寒品种，以扩大魔芋的适宜种植区域。魔芋能在较弱的光照条件下生长。外植体接种后7～14天的暗培养能有效地控制球茎或根状茎的褐变，愈伤组织形成、生长阶段的光照强度可在800～2 000勒克斯范围内。

魔芋愈伤组织的诱导生长的具体操作过程是:配制诱导培养基，以30毫升用量分装到200毫升的三角瓶或广口瓶中。在1.1～1.2千克/平方米、121℃条件下灭菌20分钟。将经过灭菌处理的材料置于超净工作台上，无菌条件下在培养皿中将外植体切成0.5厘米见方的小块，接种到愈伤组织诱导培养基上，每瓶接种5～7块，转入到25～28℃的培养室内进行暗培养。暗培养时间通常是7～14天，然后再转入25～28℃进行光照培养，光照强度1 500～2 000勒克斯，每天光照时间13小时左右。也有研究者在愈伤组织诱导阶段进行全程暗培养，培养1个月后进行切割，转接到新鲜的诱导培养基上增殖，一般在接种20～60天后获得大量愈伤组织。

(3)愈伤组织芽分化和生长。魔芋愈伤组织的器官发生对生长素、细胞分裂素的种类、含量较为敏感。在pH值调控上，采用pH5.8有利于魔芋器官的分化并有较高的成苗率。魔芋是半阴生植物，这与它原产热带茂密森林下层所形成的特性有关，这一特性使其在组培阶段，在较弱光照条件下能正常生长、分化，对于降低能耗具有特殊意义。

愈伤组织继代与芽分化的具体操作程序是:配制芽分化培养基，将上述产生的愈伤组织切割成适当大小，转接到芽分化培养基上，在27℃±2℃、1 000～2 000勒克斯，每天13小时的光照条件下培养1个月左右，即可自愈伤组织上诱导出不定芽。

(4)根的分化与生长。魔芋不定芽分化形成后，对激素的种类和要求不再敏感，魔芋生根培养基通常采用1/2MS(即将MS培养基无机盐和有机物的浓度稀释1倍)，再附加0.1～0.5毫克/升的NAA，有利于魔芋根系发生和生长，可得到一定数量的根系，而且根系洁白、粗壮，移栽后容易成活。

由于魔芋不定芽分化形成后，对激素的种类和要求不敏感，所以也有许多研究者提出“一步成苗法”，即不按常规方法另外配制生根培养基，而是按20～30天继代一次的频率，将不定芽带一定愈伤组织分割后仍在原来的继代分化培养基上培养，愈伤组织增殖、再分化、不定芽壮苗生根同时进行。笔者认为在工厂化生产中，还是采用生根培养进行壮苗生根培养更能节省成本，便于批量化生产。

2.魔芋组培成苗的关键技术环节(www.xing528.com)

综上所述，魔芋组培快繁中愈伤组织形成及植株再生的影响因子较多，其中最关键的因数还是外植体的类型和培养基的组分。

(1)外植体的选择。外植体的类型涉及植株的基因型、生理时期和部位三个方面，三者对快繁体系的建成均有重要影响。

基因型包括不同种和同一种的不同品种，不同种类的魔芋组培快繁培养基的组分不一样。适于花魔芋成苗的最适培养基是MS+ 6－BA2.0～4.0毫克/升+NAA0.5毫克/升或MS+ 6－BA2.0毫克/升+ IAA1.2毫克/升;而白魔芋最适成苗培养基是MS+ 6－BA1.0毫克/升+ NAA0.5毫克/升或MS+ 6－BA2.0毫克/升+ NAA0.6毫克/升。白魔芋分化、成苗时间相对较短，从外植体到再生植株分化形成的最短时间为72天，一般在90～100天，较花魔芋提前10～15天。

生理时期对魔芋组培快繁的影响也非常显著。在魔芋生长期取材比在休眠期取材更容易诱导出愈伤组织。休眠期的球茎切块、根状茎很难诱导出愈伤组织，有的研究者认为利用4℃低温处理可以提高出愈率。用休眠期花魔芋的球茎、根状茎、鳞片、花芽、叶芽为外植体诱导再生植株，以花芽内层粉红色鳞片为最佳外植体，培养期间不发生溶胀，污染率、褐变率、死亡率低，愈伤率达100%，继续培养可分化芽、根，于3月底至4月中旬形成完整植株，能在魔芋播种季节进行试管苗移栽，保证了种芋的生长时间，有利于提高产量和生产效益。

魔芋的相对产量较低，其中一个重要的原因是球茎休眠时间过长，休眠的彻底解除时间是在采收后4个月左右，即在次年的3月份。此时取材组培，要到7～8月份才能出瓶移栽，组培苗不能在大田种植。为了解决这一矛盾，柳俊等采取在秋冬季节用拟球茎鳞片作外植体的方法快繁。所谓拟球茎鳞片是组培过程愈伤组织分化形成的锥形芽鳞片。以此材料作外植体组培，可在4～5月份得到完整的组培苗，出瓶到大田移栽。此法的限制是必须在第一年的组培基础上进行。

取材部位也很关键。魔芋脱毒必须用茎尖培养才能达到预期的目的;休眠期应选用花芽鳞片作外植体;萌芽期的组培，也应根据不同的外植体采用不同的预处理和消毒措施，用不同的方法进行培养。

不同的外植体形成愈伤组织的能力和芽分化能力不同。顾玉成等以魔芋顶芽、顶芽鳞片、侧芽、皮上芽苞、拟球茎鳞片为外植体，在各自最适合的诱导培养基上进行愈伤组织诱导;在统一分化培养基继代，进行不定芽诱导和扩繁。结果前4者诱导愈伤组织所需时间较长，为50天;而拟球茎鳞片只需要30天。不同外植体出愈率不同，形成的愈伤组织分化能力与繁殖系数也不一样(表2)。魔芋拟球茎鳞片不定芽的诱导率为96.4%，繁殖系数为4.9，一般有7～13个芽点;而其他外植体最高的不定芽诱导率为74.2%，繁殖系数为4.1，芽点一般5～10个。

表2　不同的外植体愈伤组织诱导率和不定芽分化能力

花芽、叶芽、鳞片等外植体愈伤组织诱导率偏低，但愈伤组织分化能力强，不会因为多次切割和继代培养而影响分化能力。萌芽期的球茎、根状茎切块愈伤组织诱导率可达100%，且出愈快，外植体接种一周开始增厚，20天后在切口表面形成一层很薄的白色愈伤组织，并不断增殖，逐渐膨大成瘤状，颜色也不断加深，一般位于外植体上部的愈伤组织为淡黄色或粉红色，靠近培养基底部的愈伤组织为棕红色。以球茎、根状茎作外植体组培的缺点是愈伤组织分化能力相对芽和鳞片较弱，培养时间过长容易褐变，由保守型愈伤组织变成水渍状的衰败型愈伤组织。许多研究者为了抑制褐变，在培养过程中加入多酚氧化酶抑制剂(维生素、柠檬酸、PVP)及吸附剂(活性炭)，但效果并不显著。最有效的控制褐化的方法是及时继代，缩短培养周期，一般在20～30天内用新鲜培养基转接，淘汰衰败型愈伤组织。

在组培中外植体的选择往往关系到组培的成败，而在实践中外植体的使用又受到诸多实际因素的限制。花芽鳞片、拟球茎鳞片是秋冬季最理想的外植体，但来源均受到制约。魔芋是多年生植物，花芽只有多年生球茎才能形成;而拟球茎鳞片必须建立在头一轮组培基础上。萌芽期的球茎、根状茎、叶芽、鳞片、皮上芽苞作外植体，均能诱导愈伤组织，实现植株再生，而且几者的扩繁能力差异不大。但综合外植体来源以及外植体消毒环节考虑，笔者认为球茎、鳞片是最实用的外植体。魔芋顶芽带病少，污染轻，形成的愈伤组织植株再生能力强，但由于魔芋是单复叶植物，每个球茎只有一个顶芽，外植体来源少，在工厂化生产中应用受到限制;皮上芽苞来源较广，而且形成的愈伤组织分化能力强，但实际应用中外植体取材、清洗、消毒困难，污染重，不宜选用;鳞片来源比顶芽充足，愈伤组织诱导率和分化能力均较高，外植体易消毒，污染轻，是较为理想的外植体，只是取材时间限制在魔芋萌芽到出苗之间;球茎来源最为广泛，其芽分化能力虽不及其他外植体，但愈伤组织诱导率高，也是工厂化育苗中最适宜的外植体，但在接种中要注意消毒灭菌技术，避免污染造成的损失。

(2)培养基组分。在植物组织培养中，植物激素对器官分化的调节起着重要的作用，尤其是细胞分裂素与生长素的浓度和配比，对组织的发育方向起着决定作用。生长素主要作用是诱导刺激细胞分裂和根的分化，常用的生长素有NAA(萘乙酸)、IAA(吲哚乙酸)、IBA(吲哚丁酸)、NOA(萘氧乙酸)、P－CPA(对氯苯氧乙酸)、2，4－D(2，4－二氯苯氧乙酸)。而细胞分裂素的主要作用是刺激细胞分裂，诱导芽的分化，抑制根的生长。组培中常用的细胞分裂素有6－BA(6－苄基腺嘌呤)、KT(激动素，6－呋喃氨基腺嘌呤)。另一种常用的植物激素是赤霉素GA3，主要用于打破休眠，促进丛生芽形成。在植物愈伤诱导、植株再生过程中，细胞分裂素和生长素必须配合使用，才能达到定向调控的目的。一般来说外源激素的用量和配比取决于植物组织的内源激素水平。

有关激素对魔芋愈伤组织诱导和植株再生的影响，不同的研究者所得结果有一定差异，主要原因是基因型差异和实验室条件不同(如激素生产厂家和纯度不同，因此效果不一)造成的。如前所述，大多数研究者在愈伤组织诱导、分化和壮苗生根等不同阶段采用了不同组分的培养基。

一般在愈伤组织诱导阶段使用较低水平的细胞分裂素和一定浓度的生长素，通常细胞分裂素6－BA的浓度在0.5～1.5毫克/升之间;生长素的浓度比分化培养基要高，NAA的浓度在0.5～1.0毫克/升之间(如用IAA，浓度为1.0～2.0毫克/升)。这是因为魔芋外植体内的生长素含量较低，细胞脱分化、愈伤组织形成所需要的生长素主要来源于培养基。黄丹枫的研究结果表明，愈伤组织在IAA 0.0～2.02毫克/升的浓度内均能生长，在不含生长素的培养基中，愈伤组织的形成和生长虽可依靠自身的IAA合成代谢，但生长量和分化潜力显著受阻(表3)，她认为MS+ 6－BA1.0毫克/升+ IAA1.2毫克/升是魔芋不定芽分化频率最高的适宜培养基。

表3　培养基中IAA浓度对魔芋细胞分化及器官发生的影响

培养基中生长素含量通过影响细胞内生长素含量变化而实现细胞分化方向和分化能力的定向调控，但不是唯一的决定因素，细胞分裂素的作用也必不可少。在培养基中添加一定量的NAA、IAA、IBA、2，4－D等生长素，与适量的细胞分裂素配合使用，均能诱导球茎愈伤组织的形成和增殖，但不同的生长素作用效果不一样。IAA见光易分解，用量应稍高，在1.0～2.0毫克/升比较适宜。2，4－D是诱导愈伤组织最有效的物质，在扩繁增殖中使用低浓度的2，4－D，能促进愈伤迅速增殖;但2，4－D同时也是一种有效的器官发生抑制剂，而且它的后效持久，使用浓度必须低，在要求快繁时最好不用。NAA性质较稳定，价格实惠，是最便宜和有效的生长素，其适用浓度为0.1～1.0毫克/升(超过1.0毫克/升则会使根过早分化，不利于出苗)。

魔芋分化培养基通常含有相对较高浓度的细胞分裂素，花魔芋分化培养基6－BA的浓度2.0～4.0毫克/升，白魔芋1.0毫克/升。分化培养基中生长素的浓度与诱导阶段持平或稍低，NAA使用浓度为0.1～0.5毫克/升(如用IAA，则浓度为1.0毫克/升左右)，2，4－D对器官发生有抑制作用，在分化阶段不宜使用。这样的配比是因为在植物再生过程中，器官形成是由于生长素和细胞分裂素相互之间的比例所决定的，而不是由这些物质的绝对浓度决定。一般认为，细胞分裂素/生长素比例较高时，可能分化出芽;比例较低时，则可能分化出根。为了保证先出芽再生根，在保证继代分化中愈伤组织增殖所需生长素的基础上，增加细胞分裂素的用量，可以达到提高芽分化率的目的。通常认为适于花魔芋成苗的最适培养基为MS+ 6－BA2.0～4.0毫克/升+ NAA0.5毫克/升或MS+ 6－BA2.0毫克/升+ IAA1.2毫克/升;白魔芋成苗培养基是MS+ 6－BA1.0毫克/升+NAA0.5毫克/升或MS+ 6－BA2.0毫克/升+ NAA0.6毫克/升。而张兴国则认为为了减少变异，宜采用含植物生长调节剂较少的培养基，即MS+ 6－BA1.0毫克/升+ NAA0.1毫克/升利于芽分化。

魔芋组培苗生根较为容易，但要注意植入生根培养基时必须携带部分愈伤组织及茎的组织，否则芽的基部丧失生根能力。